一种胆固醇氧化酶亲和介质及其合成和大规模纯化胆固醇氧化酶方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及诊断用酶生产技术领域，具体是指一种胆固醇 氧化酶亲和介质及其合成和大规模纯化胆固醇氧化酶方法。

背景技术

胆固醇氧化酶(cholesterol oxidase，EC 11.3.6)简称COD，是胆固醇降解代谢过程中的 第一个酶，能专一性地催化底物胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮。微生物是胆固醇氧化酶最为主要 的来源，其在临床诊断、食品加工、生物制药、生物化学和抗虫领域有着广泛的应用。如： 利用胆固醇氧化酶测定血清中胆固醇的含量就成了临床诊断中一个重要的参考指标。在食品 工业中利用胆固醇氧化酶酶法相较物理、化学法降解胆固醇而言，具有效率高毒副作用低的 优势；同时其氧化产物在医药领域也有很好的应用前景。

Brevibacterium(短杆菌)，Streptomyces spp.(链霉菌)，Corynebacterium(棒状杆菌)， Arthrobacter(节杆菌)，Pseudomonas(假单胞菌)和Rhodococcus(红球菌)等微生物都可 以生产胆固醇氧化酶。目前，多种胆固醇氧化酶基因已经被克隆，并转入E.coli(大肠杆菌) 等基因工程菌进行表达。然而胆固醇氧化酶的分离纯化步骤通常包括了多步的硫酸铵沉淀， 表面活化剂处理，热处理，离子交换层析，分子筛层析等。而过多的纯化步骤，导致了纯化 时间较长，蛋白和活性回收率较低的结果。

为了大规模工业化地生产胆固醇氧化酶，必须减少分离纯化的步骤。因此，需要提供一 种快速高效的胆固醇氧化酶分离方法。

发明内容

本发明的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供一种胆固醇氧化酶亲和介质及其合 成和大规模纯化胆固醇氧化酶方法，利用该胆固醇氧化酶亲和介质可以大规模快速分离纯化 胆固醇氧化酶，可在仅用一步亲和层析的情况下，得到胆固醇氧化酶纯品，整个纯化步骤消 耗时间段，蛋白和活性回收率较高，适于大规模推广应用。

为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种胆固醇氧化酶亲和介质，其特点 是，所述胆固醇氧化酶亲和介质由胆固醇氧化酶亲和配体和层析介质连接而成。

较佳地，所述胆固醇氧化酶亲和配体是核黄素，所述层析介质是Sepharose、壳聚糖或聚 苯乙烯。

在本发明的第二方面，提供了一种上述的胆固醇氧化酶亲和介质的合成方法，其特点是， 将所述胆固醇氧化酶亲和配体和所述层析介质通过三聚氯氰与乙二胺作为间隔臂进行连接。

在本发明的第三方面，提供了一种利用上述的胆固醇氧化酶亲和介质大规模纯化胆固醇 氧化酶的方法，其特点是，将含有胆固醇氧化酶的溶液流经所述胆固醇氧化酶亲和介质进行 亲和吸附，然后采用清洗液冲洗所述胆固醇氧化酶亲和介质，最后用洗脱缓冲液洗脱所述胆 固醇氧化酶亲和介质上吸附的胆固醇氧化酶，从而纯化胆固醇氧化酶。

较佳地，所述的含有胆固醇氧化酶的溶液是采用基因工程方法获得的胆固醇氧化酶表达 液。

更佳地，所述胆固醇氧化酶表达液是采用来自于Brevibacterium sterolicum的胆固醇氧化酶 基因，并由Escherichia coli BL21(DE3)表达得到。通常培养液需经过离心和超声破碎处理， 破碎后再进行离心去沉淀。

较佳地，所述胆固醇氧化酶亲和配体是核黄素，所述层析介质是Sepharose、壳聚糖或聚 苯乙烯。

较佳地，所述亲和吸附的条件为pH值7.5～8.0，电导率为2～5ms/cm。

较佳地，采用清洗液冲洗所述胆固醇氧化酶亲和介质的清洗条件为pH值7.5～8.0，电导率 5～10ms/cm。

较佳地，用洗脱缓冲液洗脱所述胆固醇氧化酶亲和介质上吸附的胆固醇氧化酶的洗脱条 件为pH值7.5～8.0，电导率40～80ms/cm。

本发明的有益效果具体如下：

1、本发明通过采用FAD片段核黄素作为胆固醇氧化酶亲和配体，与层析介质连接合成 胆固醇氧化酶亲和介质，可快速高效纯化胆固醇氧化酶，适于大规模推广应用；

2、本发明通过优化蛋白质吸附条件使得胆固醇氧化酶的纯化效率显著增加，具有较大工 业应用潜力，体现出较大的经济效益。

附图说明

图1是本发明的胆固醇氧化酶亲和介质的一具体实施例的结构示意图。

图2是以Sepharose-核黄素为胆固醇氧化酶亲和介质时pH值对胆固醇氧化酶吸附量的影 响。

图3是中性条件下为胆固醇氧化酶亲和介质Sepharose-核黄素对胆固醇氧化酶的吸附量。

图4是以Sepharose-核黄素为胆固醇氧化酶亲和介质时洗脱缓冲液对胆固醇氧化酶回收 率的影响。

图5是以聚壳聚糖-核黄素为胆固醇氧化酶亲和介质时pH值对胆固醇氧化酶吸附量的影 响。

图6是中性条件下为胆固醇氧化酶亲和介质聚壳聚糖-核黄素对胆固醇氧化酶的吸附量。

图7是以聚壳聚糖-核黄素为胆固醇氧化酶亲和介质时洗脱缓冲液对胆固醇氧化酶回收率 的影响。

图8是以D840-核黄素为胆固醇氧化酶亲和介质时pH值对胆固醇氧化酶吸附量的影响。

图9是中性条件下为胆固醇氧化酶亲和介质D840-核黄素对胆固醇氧化酶的吸附量。

图10是以D840-核黄素为胆固醇氧化酶亲和介质时洗脱缓冲液对胆固醇氧化酶回收率的 影响。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。

下述实施例1-3和对比例1-3所用的胆固醇氧化酶溶液的制备：将来自于Brevibacterium sterolicum的胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达从而表达 出胆固醇氧化酶，取20ml培养的大肠杆菌菌液，加入20ml破碎缓冲液(pH～7.8，电导率 2～5ms/cm)，超声破碎，功率400w，超声5s间隔1s，共超声99个循环。取破碎液12000rpm 离心15min，取上清使用。

涉及的采用清洗液为冲洗所述胆固醇氧化酶亲和介质的清洗条件为pH值7.5～8.0，电导 率5～10ms/cm。

实施例1：Sepharose-核黄素的合成及应用

Sepharose CL 4B(100g)用10倍体积的去离子水洗涤，抽干成湿饼状；悬浮于50ml 活化缓冲液(0.8MNaOH，20％二甲亚砜，10％环氧氯丙烷)40℃摇床震荡2.5h，然后倒 入玻璃磨砂漏斗中，在抽滤下经过每次10倍体积的蒸馏水洗涤，直到洗涤液pH至中性，在 抽干成湿饼状。活化的Sepharose CL 4B介质悬浮于500ml0.1M NaOH溶液，加入20ml乙二 胺溶液，凝胶在搅拌(200rpm)下30℃恒温12h。用去离子水清洗。NH₂-Sepharose CL 4B 悬浮在350ml 50％(v/v)冰浴丙酮溶液中，随后将4g三氮嗪溶于80ml-20℃预冷丙酮， 快速加入介质悬浮液，实时检测pH值，用饱和NaHCO₃将pH维持在6.5-7.0之间，反应温 度维持在0-4℃继续搅拌2-4h，至白色消失，混合物呈透明状停止反应。用3倍介质体积的 丙酮，丙酮∶去离子水(1∶1)，去离子水，顺序洗涤反应，得二氯三氮嗪-氨基-Sepharose CL 4B。称取40g二氯三氮嗪-氨基-Sepharose CL 4B，称取10g核黄素，溶解于80ml去离子 水中，50-60℃振荡24h，反应过程中时常检查pH，用1MNaOH使溶液保持在11-12之间。 反应完毕，用500ml去离子水充分洗涤，抽干。

(1)最佳吸附pH值的确定

取胆固醇氧化酶标准品，用去离子水稀释至浓度为600μg/ml，分为6组，每组溶液调节 pH值为3.8，4.7，6.3，7.4，7.8，8.7，9.6体积1ml，分别加入0.01g湿介质，4℃充分振荡2h 后，测定上清胆固醇氧化酶浓度，计算介质的吸附量，选择最佳吸附的pH值。

初始胆固醇氧化酶～0.6mg/l，在不同pH值下与介质充分振荡2h后，大量胆固醇氧化酶 被亲和介质吸附，上清中的含量降低，吸附量与pH值关系见图2。较佳吸附条件为，温度为4 ℃，pH为7.5-8.0，电导率为2～5ms/cm。最佳吸附条件为，温度为4℃，pH为7.8，电导率为 2～5ms/cm。

(2)介质最大吸附量的确定

在pH值优化的基础上，确定介质的最大吸附量。取胆固醇氧化酶标准品，用去离子水稀 释至浓度为100，200，300，400，500，600，700，800，900μg/ml，调节pH值为7.8，分别加入 0.01g湿介质，4℃充分振荡2h后，测定上清胆固醇氧化酶浓度，计算介质的最大吸附量。 吸附量与上清蛋白浓度关系，见图3，计算单位介质最大吸附量为74.5mg/g介质。

(3)最佳洗脱条件的确定

在培养吸附条件和最大吸附量的基础上，考察洗脱液离子强度对洗脱结果的影响，结果 见图4。从图中可见，较佳洗脱调节为pH值7.5～8.0，电导率40～80ms/cm；最适洗脱条件为pH 值为7.8，电导率60ms/cm。

对比例1：Sepharose-光黄素的合成及应用

Sepharose CL 4B(100g)用10倍体积的去离子水洗涤，抽干成湿饼状；悬浮于50ml活 化缓冲液(0.8M NaOH，20％二甲亚砜，10％环氧氯丙烷)40℃摇床震荡2.5h，然后倒入 玻璃磨砂漏斗中，在抽滤下经过每次10倍体积的蒸馏水洗涤，直到洗涤液pH至中性，在抽干 成湿饼状。活化的Sepharose CL 4B介质悬浮于500ml0.1M NaOH溶液，加入20ml乙二胺溶液， 凝胶在搅拌(200rpm)下30℃恒温12h。用去离子水清洗。NH2-Sepharose CL 4B悬浮在 350ml 50％(v/v)冰浴丙酮溶液中，随后将4g三氮嗪溶于80ml-20℃预冷丙酮，快速加入 介质悬浮液，实时检测pH值，用饱和NaHCO3将pH维持在6.5-7.0之间，反应温度维持在0-4℃ 继续搅拌2-4h，至白色消失，混合物呈透明状停止反应。用3倍介质体积的丙酮，丙酮∶去离 子水(1∶1)，去离子水，顺序洗涤反应，得二氯三氮嗪-氨基-Sepharose CL4B。称取40g 二氯三氮嗪-氨基-Sepharose CL4B，称取10g光黄素(或光色素)，溶解于80ml去离子水中， 50-60℃振荡24h，反应过程中时常检查pH，用1M NaOH使溶液保持在7.5-8.0之间。反应完毕， 用500ml去离子水充分洗涤，抽干。

采用Sepharose-光黄素进行最佳吸附pH值的确定、介质最大吸附量的确定及最佳洗脱条 件的确定，实验过程同实施例1中相应的实验过程，结果显示Sepharose-光黄素基本无吸附 能力。

采用Sepharose-光色素进行最佳吸附pH值的确定、介质最大吸附量的确定及最佳洗脱条 件的确定，实验过程同实施例1中相应的实验过程，结果显示Sepharose-光黄素基本无吸附 能力。

实施例2：聚壳聚糖-核黄素的合成及应用

聚壳聚糖(100g)用10倍体积的去离子水洗涤，抽干成湿饼状；悬浮于50ml活化缓冲液 (0.8MNaOH，20％二甲亚砜，10％环氧氯丙烷)40℃摇床震荡2.5h，然后倒入玻璃磨砂漏 斗中，在抽滤下经过每次10倍体积的蒸馏水洗涤，直到洗涤液pH至中性，在抽干成湿饼状。 活化的Sepharose CL4B介质悬浮于500ml0.1MNaOH溶液，加入20ml乙二胺溶液，凝胶在搅 拌(200rpm)下30℃恒温12h。用去离子水清洗。NH₂-Sepharose CL 4B悬浮在350ml 50％ (v/v)冰浴丙酮溶液中，随后将4g三氮嗪溶于80ml-20℃预冷丙酮，快速加入介质悬浮液， 实时检测pH值，用饱和NaHCO₃将pH维持在6.5-7.0之间，反应温度维持在0-4℃继续搅拌2-4 h，至白色消失，混合物呈透明状停止反应。用3倍介质体积的丙酮，丙酮∶去离子水(1∶1)， 去离子水，顺序洗涤反应，得二氯三氮嗪-氨基-Sepharose CL 4B。称取40g二氯三氮嗪-氨 基-Sepharose CL 4B，称取10g核黄素，溶解于80ml去离子水中，50-60℃振荡24h，反应 过程中时常检查pH，用1M NaOH使溶液保持在11-12之间。反应完毕，用500ml去离子水充分 洗涤，抽干。

(1)最佳吸附pH值的确定

取胆固醇氧化酶标准品，用去离子水稀释至浓度为600μg/ml，分为6组，每组溶液调节 pH值为3.8，4.7，6.3，7.4，7.8，8.7，9.6体积1ml，分别加入0.01g湿介质，4℃充分振荡2h 后，测定上清胆固醇氧化酶浓度，计算介质的吸附量，选择最佳吸附的pH值。

初始胆固醇氧化酶～0.6mg/l，在不同pH值下与介质充分振荡2h后，大量胆固醇氧化酶 被亲和介质吸附，上清中的含量降低，吸附量与pH值关系见图5。较佳吸附条件为，温度为4 ℃，pH为7.5-8.0，电导率为2～5ms/cm。最佳吸附条件为，温度为4℃，pH为7.8，电导率为 2～5ms/cm。

(2)介质最大吸附量的确定

在pH值优化的基础上，确定介质的最大吸附量。取胆固醇氧化酶标准品，用去离子水稀 释至浓度为100，200，300，400，500，600，700，800，900μg/ml，调节pH值为7.8，分别加入 0.01g湿介质，4℃充分振荡2h后，测定上清胆固醇氧化酶浓度，计算介质的最大吸附量。 吸附量与上清蛋白浓度关系，见图6，计算单位介质最大吸附量为60.5mg/g介质。

(3)最佳洗脱条件的确定

在培养吸附条件和最大吸附量的基础上，考察洗脱液离子强度对洗脱结果的影响，结果 见图7。从图中可见，较佳洗脱调节为pH值7.5～8.0，电导率40～80ms/cm；最适洗脱条件为 pH值为7.8，电导率60ms/cm。

对比例2：聚壳聚糖-光黄素(光色素)的合成及应用

聚壳聚糖(100g)用10倍体积的去离子水洗涤，抽干成湿饼状；悬浮于50ml活化缓冲 液(0.8MNaOH，20％二甲亚砜，10％环氧氯丙烷)40℃摇床震荡2.5h，然后倒入玻璃磨 砂漏斗中，在抽滤下经过每次10倍体积的蒸馏水洗涤，直到洗涤液pH至中性，在抽干成湿 饼状。活化的Sepharose CL 4B介质悬浮于500ml0.1M NaOH溶液，加入20ml乙二胺溶液， 凝胶在搅拌(200rpm)下30℃恒温12h。用去离子水清洗。NH₂-Sepharose CL 4B悬浮在 350ml 50％(v/v)冰浴丙酮溶液中，随后将4g三氮嗪溶于80ml-20℃预冷丙酮，快速加 入介质悬浮液，实时检测pH值，用饱和NaHCO₃将pH维持在6.5-7.0之间，反应温度维持 在0-4℃继续搅拌2-4h，至白色消失，混合物呈透明状停止反应。用3倍介质体积的丙酮， 丙酮∶去离子水(1∶1)，去离子水，顺序洗涤反应，得二氯三氮嗪-氨基-Sepharose CL4B。 称取40g二氯三氮嗪-氨基-Sepharose CL 4B，称取10g光黄素(或光色素)，溶解于80ml去 离子水中，50-60℃振荡24h，反应过程中时常检查pH，用1M NaOH使溶液保持在6.5-8.0 之间。反应完毕，用500ml去离子水充分洗涤，抽干。

采用聚壳聚糖-光黄素进行最佳吸附pH值的确定、介质最大吸附量的确定及最佳洗脱条 件的确定，实验过程同实施例2中相应的实验过程，结果显示聚壳聚糖-光黄素基本无吸附能 力。

采用聚壳聚糖-光色素进行最佳吸附pH值的确定、介质最大吸附量的确定及最佳洗脱条 件的确定，实验过程同实施例2中相应的实验过程，结果显示聚壳聚糖-光黄素基本无吸附能 力。

实施例3：D840-核黄素的合成及应用

D840介质(聚苯乙烯介质，拥有游离的氨基)悬浮在350ml 50％(v/v)冰浴丙酮溶液 中，随后将4g三氮嗪溶于80ml-20℃预冷丙酮，快速加入介质悬浮液，实时检测pH值， 用饱和NaHCO₃将pH维持在6.5-7.0之间，反应温度维持在0-4℃继续搅拌2-4h，至白色 消失，混合物呈透明状停止反应。用3倍介质体积的丙酮，丙酮∶去离子水(1∶1)，去离子 水，顺序洗涤反应，得二氯三氮嗪-氨基-Sepharose CL 4B。称取40g二氯三氮嗪-氨基 -Sepharose CL 4B，称取10g核黄素(或光黄素，光色素等)，溶解于80ml去离子水中， 50-60℃振荡24h，反应过程中时常检查pH，用1M NaOH使溶液保持在11-12之间。反应 完毕，用500ml去离子水充分洗涤，抽干。

(1)最佳吸附pH值的确定

取胆固醇氧化酶标准品，用去离子水稀释至浓度为600μg/ml，分为6组，每组溶液调节 pH值为3.8，4.7，6.3，7.4，7.8，8.7，9.6体积1ml，分别加入0.01g湿介质，4℃充分振荡2h 后，测定上清胆固醇氧化酶浓度，计算介质的吸附量，选择最佳吸附的pH值。

初始胆固醇氧化酶～0.6mg/l，在不同pH值下与介质充分振荡2h后，大量胆固醇氧化酶 被亲和介质吸附，上清中的含量降低，吸附量与pH值关系见图8。较佳吸附条件为，温度为4 ℃，pH为7.5-8.0，电导率为2～5ms/cm。最佳吸附条件为，温度为4℃，pH为7.8，电导率为 2～5ms/cm。

(2)介质最大吸附量的确定

在pH值优化的基础上，确定介质的最大吸附量。取胆固醇氧化酶标准品，用去离子水稀 释至浓度为100，200，300，400，500，600，700，800，900μg/ml，调节pH值为7.8，分别加入 0.01g湿介质，4℃充分振荡2h后，测定上清胆固醇氧化酶浓度，计算介质的最大吸附量。 吸附量与上清蛋白浓度关系，见图9，计算单位介质最大吸附量为40mg/g介质。

(3)最佳洗脱条件的确定

在培养吸附条件和最大吸附量的基础上，考察洗脱液离子强度对洗脱结果的影响，结果 见图10。从图中可见，较佳洗脱调节为pH值7.5～8.0，电导率40～80ms/cm；最适洗脱条件 为pH值为7.8，电导率60ms/cm。

对比例3：D840-光黄素(光色素)的合成及应用

D840介质(聚苯乙烯介质，拥有游离的氨基)悬浮在350ml 50％(v/v)冰浴丙酮溶液 中，随后将4g三氮嗪溶于80ml-20℃预冷丙酮，快速加入介质悬浮液，实时检测pH值， 用饱和NaHCO3将pH维持在6.5-7.0之间，反应温度维持在0-4℃继续搅拌2-4h，至白色 消失，混合物呈透明状停止反应。用3倍介质体积的丙酮，丙酮∶去离子水(1∶1)，去离子 水，顺序洗涤反应，得二氯三氮嗪-氨基-Sepharose CL 4B。称取40g二氯三氮嗪-氨基 -Sepharose CL 4B，称取10g光黄素(或光色素)，溶解于80ml去离子水中，50-60℃振荡 24h，反应过程中时常检查pH，用1M NaOH使溶液保持在6.5-8.0之间。反应完毕，用500ml 去离子水充分洗涤，抽干。

采用D840-光黄素进行最佳吸附pH值的确定、介质最大吸附量的确定及最佳洗脱条件的 确定，实验过程同实施例2中相应的实验过程，结果显示D840-光黄素基本无吸附能力。

采用D840-光色素进行最佳吸附pH值的确定、介质最大吸附量的确定及最佳洗脱条件的 确定，实验过程同实施例2中相应的实验过程，结果显示D840-光黄素基本无吸附能力。

因此，本发明提供了一种具有工业应用潜力的分离纯化胆固醇氧化酶的方法，其使用 sepharose-核黄素亲和层析一步分离纯化胆固醇氧化酶，蛋白回收率为～10％，活性回收率为～ 90％，比活性为～16U/mg。使用壳聚糖-核黄素亲和层析一步分离纯化胆固醇氧化酶，蛋白回 收率为～10％，活性回收率为～91％，比活性为～16U/mg。使用D840-核黄素亲和层析一步分 离纯化胆固醇氧化酶，蛋白回收率为～8％，活性回收率为～85％，比活性为～16U/mg。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种 修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限 制性的。