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红景天和党参合剂对小鼠免疫功能的影响

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第一章 前言

1.1中草药保健食品研究现状

1.2中草药保健食品功能研究

1.3中草药保健食品剂型

1.4中草药保健食品安全性问题

1.5中草药保健食品发展趋势

1.6红景天及党参研究现状

1.7复方中药制剂研究现状

第二章 材料与方法

2.1主要试剂和仪器

2.2脾细胞悬液的制备

2.3小鼠脾淋巴细胞增殖实验

2.4小鼠 NK 细胞活性及最佳检测时间实验

2.5红景天与党参提取物制备

2.6含药血清的制备

2.7细胞悬液的制备

2.8脾淋巴细胞增殖实验

2.9 NK 细胞活性实验

2.10脾淋巴细胞增殖及 NK 细胞活性验证实验

2.11小鼠体内淋巴细胞增殖和 NK 细胞活性实验

2.12小鼠脏器指数的测定

2.13小鼠白细胞数的测定

2.14小鼠迟发型变态反应实验

2.15测定小鼠脾细胞培养上清液中细胞因子水平

2.16红景天和党参合剂中功能因子含量的测定

2.17 HPLC 仪器精密度、稳定性、重复性、加样回收率实验

2.18统计学分析

第三章 结果

3.1T、B 淋巴细胞增殖实验最佳细胞浓度

3.2测定NK细胞活性的最佳时间

3.3NK 细胞杀伤活性测定的最佳靶细胞浓度

3.4红景天与党参最佳配比的体外析因设计实验结果

3.5小鼠体质量的变化

3.6小鼠体内实验脏器指数及白细胞计数结果

3.7红景天与党参合剂对小鼠免疫功能指标的检测结果

3.8小鼠脾细胞培养上清液中细胞因子测定结果

3.9小鼠迟发型变态反应实验结果

3.10红景天和党参合剂中功能因子含量结果

3.11HPLC实验测定结果

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

附录A(攻读学位期间发表论文目录)

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摘要

目的:随着生活质量的日益提高,人们对健康的期待也越来越高。人们不只把健康目标定位在生病治疗,而是愈加重视对疾病的预防和平日里的养生。所以,人们逐渐意识到要加强自身的免疫体统功能,增强对疾病的抵抗能力,从而使自己远离疾病的痛苦。自然地,具有增强免疫功能的中草药也愈发被重视起来,逐渐被人们所信赖,也正逐渐走向寻常百姓家。本实验探讨用新型四唑盐 MTS比色法在 T、B淋巴细胞增殖和 NK细胞杀伤活性实验中最佳的实验条件。应用血清药理学方法探讨红景天提取物(RSE)与党参提取物(CPE)提高免疫功能的最佳配伍剂量及其合剂对小鼠免疫功能的影响。并采用苯酚硫酸法及高效液相法测定药材中功能因子的成分含量,更好的说明红景天党参合剂具有提高免疫功能的作用。
  方法:
  1.采用MTS-PMS法测定脾细胞增殖及 NK细胞活性的实验:无菌摘取BALB/c品系小鼠脾脏,制成不同浓度的脾细胞悬液,加入脂多糖(LPS)和刀豆球蛋白A(ConA)刺激小鼠脾淋巴细胞增殖;加入活性最高的对数增长期的小鼠淋巴瘤细胞YAC-1、小鼠肝癌细胞 H22细胞作为靶细胞检测 NK细胞杀伤活性。移入96孔板中培养,过后加入MTS-PMS试剂在492nm处检测OD值。根据不同细胞浓度与OD值关系曲线确定MTS-PMS法的最适细胞浓度及最佳检测时间。
  2.体外血清药理学实验:采用3×3析因设计,制备9种不同浓度的CPE和RSE混合含药血清,通过在体外测定T、B淋巴细胞增殖能力和NK细胞杀伤活性,确定CPE和RSE的最佳组合剂量。
  3.小鼠体内实验:用该组合剂量缩小2.5、5及10倍作为RSE+CPE合剂高、中、低剂量组,进行小鼠体内实验,测T、B淋巴细胞的增殖NK细胞的杀伤能力。采用ELASA方法测定小鼠脾细胞培养上清液中白细胞介素-2、6、10(IL-2、6、10)、干扰素(IFN-γ)及肿瘤坏死因子(TNF-α)的含量。
  4.小鼠迟发性变态反应试验:采用上述喂养条件喂养小鼠30天,进行迟发性变态反应试验。
  5.功能因子含量测定实验:采用苯酚硫酸法和高效液相法分别检测党参多糖、红景天苷和酪醇含量,并进行精密度、稳定性、重复性、加样回收率实验。
  结果:
  1.MTS-PMS法确定的小鼠脾淋巴细胞增殖能力最强的脾细胞浓度为3.2×106个/mL;当靶细胞为YAC-1时,MTS-PMS法确定最佳的NK细胞杀伤活性的脾细胞浓度为8×105个/mL,即效靶比为20:1;当靶细胞为H22细胞时,MTS-PMS法确定最佳的NK细胞杀伤活性的脾细胞浓度为1.6×106个/mL,即效靶比为40:1。加入MTS-PMS后8h的吸光度最大,16h的吸光度与8h无显著差异。
  2.血清药理学实验结果,与空白组相比,RSE200mg·kg-1+CPE790mg·kg-1剂量组由ConA、LPS诱导的T、B淋巴细胞增殖能力及NK细胞活性明显升高(P<0.05)。
  3.小鼠体内实验结果,与环磷酰胺组比较,RSE+CPE合剂中剂量组(RSE40mg·kg-1+CPE158mg·kg-1)和高剂量组(RSE80mg·kg-1+CPE316mg·kg-1)的脾脏指数明显增高(P<0.05);与合剂低剂量组(RSE20mg·kg-1+CPE79mg·kg-1)比较,合剂中剂量组白细胞数明显增高(P<0.05)。与环磷酰胺组比较,合剂高、中和低3个剂量组及阳性药物CVT-200(富含西洋参多糖的免疫增强剂)组ConA、LPS诱导的T、B淋巴细胞增殖能力及NK细胞活性均显著增高(P<0.05);与CVT-200组、合剂高剂量和低剂量组比较,合剂中剂量组T、B淋巴细胞增殖能力及NK细胞杀伤活性均显著增高(P<0.05)。RS-CPE合剂中剂量组均可提高白细胞介素-2、6、10(IL-2、6、10)、干扰素(IFN-γ)及肿瘤坏死因子(TNF-α)的含量(P<0.05)。
  4.与空白对照组比较,其余各组的耳肿胀程度均显著降低(P<0.05)。CVT-200组、RS-CPE合剂高、中、低剂量组耳肿胀程度均高于CTX组(P<0.05)。RS-CPE合剂高低剂量组及低剂量组耳肿胀程度均低于CVT-200组。RS-CPE合剂中剂量组耳肿胀程度显著高于RS-CPE合剂高及低剂量组(P<0.05)。
  5.苯酚硫酸法结果显示,党参多糖的平均含量为26.21mg/g;HPLC测定的红景天苷和党参含量分别为0.484mg/g及1.087mg/g。
  结论:
  1.MTS-PMS法检测淋巴细胞增殖能力的最佳细胞浓度3.2×106个/mL,加入MTS-PMS后最佳测定时8h~16h。检测NK细胞活性时,因靶细胞种类不同所需效靶比不同。
  2.红景天和党参合剂体内免疫调节的最佳配伍剂量为RSE-CPE:RSE40mg·kg-1+CPE158mg·kg-1。
  3.红景天和党参提取物合剂有增强小鼠免疫功能的作用。

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