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2型糖尿病病人基于尿液拉曼光谱的骨量异常诊断方法的初步研究

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目的： 了解2型糖尿病病人不同骨量状态下尿液拉曼光谱的变化及其差异，分析差异与骨代谢异常之间的关系。 方法： 2型糖尿病病人经双能X线(dual-energy X-ray absorptiometry,DXA)检测诊断为骨量正常者(30例)作为对照组，骨量减少的2型糖尿病病人(30例)作为实验组1，骨质疏松的2型糖尿病病人(31例)作为实验组2。根据相关伦理审查程序及规范，并与研究对象签订相关知情同意书。研究对象全体进行尿液的收集、全血、血清的采集，分别进行检测尿液表面增强拉曼光谱(Surface enhanced Raman spectroscopy,SERS)、体重指数及糖化血红蛋白、空腹C肽、血脂代谢指标、骨转换标志物及性激素指标，比较研究体重指数、骨转化指标、生化及性激素指标与拉曼光谱检测结果的相关性，以初步验证尿液拉曼光谱方法在2型糖尿病病人骨代谢疾病诊断中的应用的可行性与可靠性。 结果： 1.研究对象的生化等指标 经统计，各组研究对象的年龄、体重指数(body mass index,BMI)、骨转化标志物、血脂、性激素指标都呈正态性分布。分别对其进行单因素方差分析后显示，总Ⅰ型胶原氨基端肽(TP1NP)、总维生素D、骨钙素、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹C肽、垂体泌乳素(PRL)、雌二醇(E2)、睾酮(T)、孕酮(P)、性激素结合球蛋白(SHBG)无统计学差异(P＞0.05)。骨量正常组、骨量减少组、骨质疏松组年龄分别为(50.13±11.71)岁、(62.07±7.84)和(65.71±10.05)岁，与正常组比有显著统计学差异(P＜0.01)，而骨量减少组和骨质疏松组年龄无统计学差异(P＞0.05)。骨量正常组、骨量减少组、骨质疏松组BMI分别为(21.45±3.08)k g/m2、(22.85±3.15)k g/m2和(23.10±3.70)k g/m2，与正常组比有显著统计学差异(P＜0.01)，而骨量减少组和骨质疏松组BMI无统计学差异(P＞0.05)。骨量正常组、骨量减少组、骨质疏松组骨转换标志物Ⅰ型胶原C端肽(CTX)水平分别为(0.33±0.12)ng/mL、(0.45±0.06)ng/mL和(0.55±0.25)ng/mL，与正常组比具有统计学差异(P＜0.05)，而骨量减少组和骨质疏松组CTX无统计学差异(P＞0.05)。骨量正常组、骨量减少组、骨质疏松组胆固醇(TC)水平分别为(4.65±0.83)mmol/L、(5.13±0.94)mmol/L和(5.18±1.17)mmol/L，与正常组比具有统计学差异(P＜0.05)，而骨量减少组和骨质疏松组TC无统计学差异(P＞0.05)。骨量正常组、骨量减少组、骨质疏松组低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平分别为(2.66±0.54)mmol/L、(2.97±0.62)mmol/L和(2.97±0.65)mmol/L，与正常组比具有统计学差异(P＜0.05)，而骨量减少组和骨质疏松组LDL-C无统计学差异(P＞0.05)。骨量正常组、骨量减少组、骨质疏松组促卵泡生成激素(FSH)水平分别为(22.63±25.17)mIU/ml、(40.25±36.22)mIU/ml和(40.11±30.27)mIU/ml，与正常组比具有统计学差异(P＜0.05)，而骨量减少组和骨质疏松组FSH无统计学差异(P＞0.05)。骨量正常组、骨量减少组、骨质疏松组促黄体生成激素(LH)水平分别为(12.72±14.51)mIU/ml、(19.09±17.3)mIU/ml和(20.03±15.84)mIU/ml，与正常组比具有统计学差异(P＜0.05)，而骨量减少组和骨质疏松组LH无统计学差异(P＞0.05)。 2．三组尿液归一化平均拉曼光谱图的图形比较 将经过平滑和归一化处理后的骨量正常组、骨量减少组以及骨质疏松组的三组平均拉曼光谱进行对比，后面两组的拉曼光谱谱峰相较于骨量正常组未见明显的左右偏移。将峰强1000cm-1处的位移作为例子，三组间的无统计学差异。在200cm-1至2000cm-1的波数范围内总共找到10个特征峰，分别位于253cm-1、300cm-1、451cm-1、572cm-1、785cm-1、890cm-1、1000cm-1、1377cm-1、1434cm-1、1525cm-1处。在253cm-1之前，骨量正常组整体谱峰归一化强度明显高于骨量减少组及骨质疏松组，骨量减少组与骨质疏松组的拉曼谱线明显向下移位。在300c m-1至1377cm-1范围内，骨量正常组与骨质疏松组整体谱峰归一化强度明显高于骨量减少组，骨量减少组的拉曼谱线明显向下移位。在1377c m-1之后，三组尿液归一化平均拉曼光谱图基本未见明显差异。在253c m-1处，骨质疏松组与骨量正常组相比，P值小于0.01，有显著统计学意义。骨量减少组与骨质疏松组相比，P值小于0.01，有显著统计学差异。在1377cm-1处，骨质疏松组、骨量减少组分别与骨量正常组相比，P值小于0.01，有显著统计学差异。骨量减少组与骨质疏松组相比，P值小于0.01，有显著统计学差异。在1430cm-1处，骨量减少组与骨量正常组相比，P值小于0.05，有统计学差异。在1525cm-1处，骨质疏松组、骨量减少组分别与骨量正常组相比，P值均小于0.01，有显著统计学差异。骨量减少组与骨质疏松组相比，P值小于0.01，有显著统计学差异。 3．骨量异常组与骨量正常组I1377相对强度对比结果 计算骨量正常组与骨质疏松组共计61位研究对象，各自在其特征峰1377c m-1处的相对峰强度——即波峰与波谷的比值，同时根据比值结果绘制散点图，如图6所示。图中可见，骨质疏松症病人与骨量正常者的散点图分布有明显差异，以1.4为分界值作横线。骨质疏松症病人的散点大部分集中在分界值横线以下，而绝大多数的骨量正常者的尿液拉曼光谱I1377/I1070比值大于1.4。计算骨量正常组与骨量减少组共计60位研究对象，各自在其特征峰1377c m-1处的相对峰强度——即波峰与波谷的比值，同时根据比值结果绘制散点图，如图7所示。图中可见，骨量减少的病人与骨量正常者的散点图分布有明显差异，以1.4为分界值作横线。骨量减少的病人的散点大部分集中在分界值横线以下，而绝大多数的骨量正常者的尿液拉曼光谱I1377/I1070比值大于1.4。而骨质疏松症病人与骨量减少的病人散点图分布无明显差异，如图8所示。为了更加进一步地验证这种区分方法的准确度，可以通过判别分析法进行进一步的验证，验证的结果如表4、表5所示。采用这种区分方法对31例骨质疏松症病人中的25例做出了正确的诊断，6例误诊；30例骨量正常者中的21例做出了正确诊断，9例误诊为骨质疏松症。通过计算，诊断的灵敏度和特异度分别为80.6%和70.0%，综合正确率为75.4%。对30例骨量减少的病人中的23例做出了正确的诊断，7例误诊；30例骨量正常者中的21例做出了正确诊断，9例误诊为骨质疏松症。通过计算，诊断的灵敏度和特异度分别为76.7%和70.0%，综合正确率为73.3%。 4．三组尿液拉曼光谱的主成分分析以及判别分析结果 将本实验的3组实验对象，共计91例标本的拉曼光谱分别以其1377c m-1处的峰强度为基准对其他9个剩余的特征峰进行峰值的归一化处理，并且计算每一例拉曼光谱归一化之后的特征值PCA得分。KMO取样适切性量数为0.853＞0.6，说明数据适合做因子分析。巴特利特球形度检验显著性P值为3.313E-299＜0.05，也说明数据适合做因子分析。最终计算出两个特征值大于1的主成分，累计贡献率为85.977%，见表6。最后，利用计算得到的PC A得分来进行判别分析和检查验证。诊断骨质疏松的灵敏度为67.7%，特异度为86.7%，总体判别的准确度为77.0%；诊断骨量减少的灵敏度为63.3%，特异度为93.3%，总体判别的准确度为78.3%。 结论： 1、2型糖尿病患者骨量异常组和骨量正常组的尿液拉曼光谱图在强度方面有差异； 2、2型糖尿病骨质疏松组尿液拉曼光谱所显示的生物分子信息与疾病生化指标改变相一致； 3、尿液拉曼光谱检测对诊断2型糖尿病骨量异常有参考意义。

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