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不同长度戊型肝炎病毒ORF2截短蛋白的免疫原性和抗原性研究

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摘要

符号、变量、缩略词等本论文专用术语的注释表

文献综述 戊型肝炎病毒的流行概况以及戊型肝炎疫苗的研究进展

第1章 HEV结构蛋白pORF2截短蛋白的大肠杆菌表达、纯化及特性分析

1．1 前言

1．2 材料与方法

1．2．1 主要材料、试剂和仪器

1．2．2 实验方法

1．3 结果

1．3．1 目的基因扩增

1．3．2 重组质粒的构建与鉴定

1．3．3 重组蛋白的诱导表达

1．3．4 重组蛋白的可溶性分析

1．3．5 重组蛋白的结构分析

1．3．6 重组蛋白的纯化及定量

1．4 讨论

1．5 小结

第2章 HEV截短蛋白p166、p179、pORF2aa439~660、pORF2aa422~4137、pORF2aa430~660抗原性和免疫原性研究

2．1 前言

2．2 材料和方法

2．2．1 主要材料、试剂和仪器

2．2．2 实验方法

2．3 结果

2．3．1 小鼠免疫血清抗HEV特异性IgG抗体水平比较

2．3．2 基于生物信息学对三种蛋白抗原表位的分析

2．4 讨论

2．5 小结

第3章 HEV截短蛋白p166、p179、pORF2aa439~660、pORF2aa422~637、pORF2aa430~660在体外中和活性的研究

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 主要材料、试剂和仪器

3．2．2 实验方法

3．3 结果

3．3．1 一步法RT-PCR体外中和活性的鉴定

3．4 讨论

3．5 小结

参考文献

致谢

作者简介

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摘要

本文主要从以下几部分进行论述：
　　一.截短蛋白pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660的原核表达及其特性分析
　　由于蛋白质能否有效表达很难预测，实验早期以p179为基础共设计了20个不同长度的pORF2截短片段进行表达尝试。利用基因重组技术构建了含有HEV ORF2的pET28a重组质粒，并在大肠杆菌中进行表达，其中13个截短蛋白可以得到高效表达。
　　在成功表达的13种蛋白中，我们选取了片段较长的3个重组蛋白pORF2aa439～4660、pORF2aa422～637和pORF2aa430～660进行蛋白质的可溶性分析，发现这3种不同长度的蛋白都可以在细菌裂解上清中存在，呈可溶性表达。最后根据表达蛋白所携带的His标签，利用镍离子金属螯合亲和层析技术获得了纯化蛋白。
　　二.截短蛋白pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660与p179、p166免疫原性和抗原性的比较研究
　　为了进一步研究3种不同长度的截短蛋白与p166、p179的免疫原性和抗原性的差异，将纯化后的5种HEV重组蛋白以生理盐水稀释至100mg/L，然后分别加入等体积铝佐剂(1g/L)，颠倒混匀30min，即为制备的实验性戊肝疫苗。用皮内注射的方法分别免疫5组小鼠，每组6只，每只200μl（含抗原10μg），并于首次免疫后的第3周，第5周及第33周各进行1次加强免疫，免疫剂量和途径与首次免疫相同。定期采集小鼠血清，分别用p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660作为包被抗原来检测p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660免疫后血清中的抗-HEV IgG抗体，观察抗体滴度的升高、维持、下降等变化过程直至首次免疫后第35周，将同组小鼠的每一份血清在同一稀释度下所测OD值取平均值进行统计。结果如下:
　　A.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周，p166免疫小鼠所得血清用p166包被检测，抗-HEV IgG抗体滴度分别为1∶1600、1∶6400、1∶51200、1∶25600、1∶3200和1∶51200;用p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660包板检测，抗体滴度相同，分别为1∶800、1∶3200、1∶25600、1∶12800、1∶3200、1∶25600;
　　B.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周，p179免疫小鼠所得血清用p166检测，抗-HEV IgG抗体滴度分别为1∶3200、1∶12800、1∶51200、1∶25600、1∶6400、1∶51200;用 p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660包板检测，所得抗体滴度相同，均分别为1∶1600、1∶12800、1∶51200、1∶12800、1∶6400、1∶51200;
　　C.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周，pORF2aa439～660免疫小鼠所得血清用p166检测，抗-HEV IgG抗体滴度分别为1∶12800、1∶409600、1∶1638400、1∶204800、1∶204800、1∶1638400;用p179包被检测，抗体滴度分别为1∶3200、1∶102400、1∶819200、1∶102400、1∶204800、1∶1638400;用pORF2aa439～660检测，抗体滴度分别为1∶6400、1∶102400、1∶409600、1∶204800、1∶204800、1∶819200;用pORF2aa422～637检测，抗体滴度分别为1∶3200、1∶102400、1∶409600、1∶204800、1∶204800、1∶1638400;用pORF2aa430～660检测，抗体滴度分别为1∶3200、1∶102400、1∶409600、1∶204800、1∶204800、1∶819200;
　　D.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周，pORF2aa422～637免疫小鼠所得血清用p166检测，抗-HEV IgG抗体滴度分别为1∶6400、1∶204800、1∶819200、1∶204800、1∶204800、1∶1638400;用p179检测，抗体滴度分别为1∶3200、1∶102400、1∶819200、1∶204800、1∶204800、1∶1638400;用pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660检测，抗体滴度相同均分别为1∶6400、1∶204800、1∶819200、1∶204800、1∶204800、1∶819200;
　　E.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周，pORF2aa430～660免疫小鼠所得血清用p166检测，抗-HEV IgG抗体滴度分别为1∶6400、1∶409600、1∶819200、1∶204800、1∶204800、1∶819200;用p179检测，抗体滴度分别为1∶3200、1∶102400、1∶409600、1∶204800、1∶204800、1∶819200;用pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660检测，抗体滴度相同均分别为1∶6400、1∶204800、1∶409600、1∶204800、1∶204800、1∶409600。
　　F.运用生物信息学分析软件，对p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660的中和抗原表位的突出情况作了分析，结果显示5种蛋白的中和抗原表位突出面积分别为12.93,12.01,9.681,11.24以及9.372，此数据说明五种蛋白天然二聚体状态下p166突出程度最明显，pORF2aa430～660突出程度最弱，可以部分解释p166的抗原性优于其他4种截短蛋白的原因。
　　综合上述研究结果，我们发现在相同的免疫时间点，pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660免疫小鼠的血清滴度明显高于p166、p179的血清滴度，说明长片段蛋白的免疫原性明显好于短片段蛋白。此外，同一份血清，在相同滴度下，用p166包被检测所得OD值的平均值大于其他4种蛋白所检测的OD值的平均值，经t检验差异具有统计学意义，提示p166的抗原性强于其他4种蛋白。
　　三.p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660免疫血清的HEV中和作用
　　本实验采用基于PCR的HEV体外中和试验，来评价p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660免疫小鼠血清的中和活性。结果如下:
　　A.p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637和pORF2aa430～660的小鼠免疫血清均有中和作用，其中和效价分别为1∶8、1∶8、1∶80、1∶80和1∶4。pORF2aa439～660，pORF2aa422～637免疫血清中和效价最高，pORF2aa430～660免疫血清中和效价最低。
　　结论:
　　1.在p179的基础上进行N端和C端的延长，能够获得包含更多抗原表位的、具有良好可溶性的、并可以二聚体形式出现的HEV pORF2截短蛋白;
　　2.新的截短蛋白pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660和p166、p179进行比较发现，5种蛋白均具有良好的免疫原性和抗原性，pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660免疫原性优于p166和p179，而p166的抗原性优于pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660和p179;
　　3.pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660诱导产生的免疫血清均具有中和活性，但pORF2aa430～660片段的免疫血清中和效价最低，pORF2aa439～660、pORF2aa422～637免疫血清中中和抗体的效价较高，该两截短蛋白有可能作为戊型肝炎重组疫苗的候选片段，值得深入研究。

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