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NSCLC铂类药物化疗敏感性与DNA损伤修复基因多态性及HMGA1表达的相关性研究

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文献综述 基因单核苷酸多态性与非小细胞肺癌铂类化疗相关性的应用进展

第一部分 hMLH1、hMSH2、ERCC1、XRCC1单核苷酸多态性与NSCLC铂类药物化疗敏感性及预后的研究

前言

参考文献

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 RNA干扰抑制肺腺癌细胞HMGA1表达和洛铂化疗敏感性关系的实验研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

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摘要

本研究分为二部分： 第一部分：hMLH1、hMSH2、ERCC1、XRCC1单核苷酸多态性与NSCLC铂类药物化疗敏感性及预后的研究 目的: 我国肺癌的发病率和死亡率位居城市人口中恶性肿瘤之首。其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占85％，约三分之二左右的患者诊断时已是晚期。手术、化疗、放疗是治疗NSCLC的主要措施，但NSCLC的5年生存率仍然不到15％。而含铂类药物的联合化疗方案仍是NSCLC，尤其是晚期NSCLC主要的治疗措施，其有效率约30％-40％，5年生存率只改善5％左右，且化疗过程中易出现复发、耐药。不同个体对铂类药物敏感性有很大差异，这很大程度上是由于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)造成的。肿瘤细胞对铂类药物的敏感性与DNA损伤修复能力、GST酶等某些代谢酶的活性、载体介导的转运蛋白及影响细胞死亡的DNA损伤耐受途径等都有着密切的关系。本研究利用一种新型SNP检测方法，探讨以下四种重要的DNA损伤修复基因，即:错配修复基因hMLH1(mismatch repair gene human mutL homologue1)和hMSH2(mismatch repair gene human mutS homologue2)、核苷酸切除修复交叉互补组基因1(excision repair cross-complementation group1，ERCC1)和人类X射线交错互补修复基因1(x-ray repair cross-complementinggroup1，XRCC1)，它们的SNP与晚期NSCLC患者对铂类药物化疗敏感性及临床预后的相关性。 方法: 经病理学确诊的晚期NSCLC患者120例，采用顺铂(ciaplatin， DDP)或卡铂(carboplatin，CBP)为主的联合化疗方案，化疗2-3个周期后按实体瘤疗效评价标准(response evaluation criteria in solid tumor，RECIST)评价疗效。所有患者均在化疗前抽取静脉血5ml，采用改进的三维基因芯片微阵列的方法分析DNA修复基因的多态性，并随机抽取10％的样本进行测序来验证该方法的准确性，比较不同基因型与化疗敏感性及化疗后临床预后之间的关系。组间比较采用卡方检验，比值比(odds ratios，OR)及其95％可信区间(confidence intervals，CI)由统计软件SPSS13.0进行统计学分析。 结果: 1.成功进行基因分型，野生型、杂合型和突变型的叠加荧光分别显示为绿色、黄色和红色。测序结果与基因芯片检测的结果完全吻合。 2.携带hMSH2-gIVS12-6 T/T、T/C、C/C基因型的患者化疗有效率(responserate，RR)分别为22.0％、26.5％和75.0％，各基因型间比较差异有统计学意义（P=0.000）;携带ERCC1(C118T) C/C、C/T、T/T基因型的患者，化疗RR分别为19.2％、37.5％和85.7％，各基因型间比较差异有统计学意义(P=0.001);携带XRCC1(G399A) G/G、G/A、A/A基因型的患者化疗RR分别为43.8％、17.0％、26.3％，各基因型间比较差异有统计学意义(P=0.012)。hMSH2、ERCC1(C118T)和XRCC1(G399A)基因型状态与化疗有效率之间有显著相关性，其中h MS H2-giVS12-6突变型、ERCC1(C118T)突变型以及XRCC1(G399A)野生型患者化疗RR较高。 3.ERCC1(C118T)杂合型与突变型患者铂类药物化疗后的中位生存期、1年、2年及3年生存率分别为13.5个月、59.5％、19.0％和14.3％，与野生型患者相比差异有显著性(P＜0.05);XRCC1(G399A)野生型患者铂类药物化疗后的中位生存期、1年、2年及3年生存率分别为15.2个月、59.1％、15.9％和6.8％，与杂合型及突变型患者比较有统计学差异（P＜0.05）。 结论: 1.本研究发现NSCLC患者的DNA损伤修复基因hMSH2-gIVS-12-6、ERCC1(C118T)和XRCC1(G399A)的SNP分别与NSCLC铂类药物化疗敏感性有关，有可能作为NSCLC患者对铂类药物化疗疗效的预测指标。 2.研究发现ERCC1(C118T)和XRCC1(G399A)的基因多态与NSCLC铂类药物化疗后的生存期有关，有可能作为铂类药物化疗后生存期的预后指标。 3.改进的三维基因芯片微阵列检测方法准确、高通量且价格低廉，适用进行大规模样本SNP实验及临床检测。 第二部分：RNA干扰抑制肺腺癌细胞HMGA1表达和洛铂化疗敏感性关系的实验研究 目的: 高迁移率族蛋白组A1(high mobility group protein A1，HMGA1)是非组蛋白染色质蛋白，自身没有激活或抑制转录的作用，但可以参与在DNA上，装配大的多蛋白复合体，使之与转录体系相互作用，从而正向或负向调节一些基因的表达。研究发现HMGA1在许多恶性肿瘤中高表达。慢病毒介导的RNA干扰技术能够有效地沉默细胞内基因表达。本研究探讨小干扰RNA沉默HMGA1表达对肺腺癌细胞株SPCA-1铂类药物敏感性的影响。 方法: 把从上海吉凯基因化学公司合成的HMGA1 siRNA慢病毒载体转染至肺腺癌细胞株SPCA-1。采用半定量RT-PCR和Western印迹检测其对细胞HMGA1基因表达的影响;MTT、克隆集落形成实验检测洛铂对转染HMGA1 siRNA细胞组和对照组细胞生长、增殖的影响;流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;分光光度法检测转染组和对照组细胞株中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活化程度。所有数据由统计软件SPSS13.0进行统计学分析。 结果: 1.RT-PCR结果提示转染HMGA1 siRNA细胞组HMGA1mRNA的表达量为0.22±0.01，对照组为1.15±0.03，空白组为1.14±0.03，转染组与对照组积空白组比较差异有显著性(P＜0.05);Western印迹结果显示，转染组HMGA1mRNA的表达量为0.13±0.01，对照组为0.93±0.04，空白组0.94±0.03，转染组与对照组和空白组比较差异有显著性(P＜0.05)。 2.用不同浓度的洛铂处理细胞24小时后，MTT法显示转染组较对照组细胞生长抑制率显著降低(P＜0.05);集落形成率明显增高(P＜0.05);流式细胞仪检测结果显示转染组细胞凋亡率较对照组降低(P＜0.05);分光光度法检测结果提示转染组Caspase-3、caspase-8和caspase-9活化度均低于对照组，差异有显著性(P＜0.05)。 结论: 1.肺腺癌细胞株SPCA-1大量表达HMGA1。 2.转染HMGA1 siRNA慢病毒质粒后的肺腺癌细胞株对洛铂的化疗敏感性明显降低，其机制可能和抑制凋亡传导信号因子有关。 3.HMGA1基因RNAi是一种有效的干扰细胞HMGA1基因表达的实验技术，应用RNAi技术能够更好地研究HMGA1基因的功能。

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