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【6h】

食管鳞癌DNA修复酶hOGG1表达的改变及其意义

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绪论

第一章 文献综述:DNA修复酶hOGG1及其与人类疾病相关性的研究进展

第二章 hOGG1在食管鳞癌组织中表达的改变及其意义

前言

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第三章 食管鳞痛细胞中hOGG1表达的改变及该细胞对氧化剂和化疗药物的耐受性

前言

第一节 建立hOGG1蛋白高表达的食管鳞癌细胞模型

1.材料

2.方法

3.结果

第二节 食管鳞癌细胞hOGG1表达的改变及其对氧化剂的耐受性

1.材料

2.方法

3.结果

第三节 食管鳞癌细胞hOGG1表达的改变及其对化疗药物的耐受性

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

结论

致谢

参考文献

作者简介

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摘要

由于各种内外因素的共同作用，基因组DNA容易受到氧自由基的攻击而发生氧化损伤（oxidative DNA damage），氧化损伤可导致DNA突变的发生，8-羟基鸟嘌呤（8-oxoguanine，8-oxoG）是 DNA氧化损伤的重要产物，8-oxoG会与腺嘌呤（A）和胞嘧啶（C）以相同的效率进行配对，这样，经过两次复制，就会导致基因组DNA发生G：C→T：A颠换。正常情况下，机体可通过修复酶系统对DNA突变进行修复，哺乳动物细胞内能够特异性修复8-oxoG的酶，被称为8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶（8-oxoguanine DNA glycosylase，OGG1），在人体内又称为人8-羟基鸟嘌呤 DNA糖苷酶（human8-oxoguanine DNA glycosylase，hOGG1）。hOGG1是碱基切除修复途径（base excision repair，BER）的关键酶。
　　 由于经常暴露于烟酒、冷热等刺激因素下，食管较容易受到氧化损伤，我国是食管癌的高发国家，主要病理类型是食管鳞状上皮细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）。食管癌由于其早期症状不明显、不典型，容易被忽略，所以被检出时往往已到晚期或伴有淋巴转移，所以手术切除和化疗在食管癌的治疗中占据了重要地位。
　　 本文旨在探讨DNA损伤修复酶hOGG1在临床食管鳞癌组织中表达的变化，及其与8-oxoG氧化损伤程度、凋亡指数和临床病理特征之间的关系，用于指导食管鳞癌患者术后个体化治疗方案的制定。
　　 1.收集食管鳞状上皮细胞癌手术切除新鲜标本42例和存档蜡块26例，免疫组化法检测68例鳞癌和癌旁组织中hOGG1蛋白的表达情况。结果显示：hOGG1蛋白在癌组织和癌旁组织均有不同程度的表达，主要表达在胞核，在不同鳞癌患者组织中的表达存在个体差异，57例鳞癌组织中hOGG1蛋白较癌旁组织的表达明显减少（t=12.55，P<0.001）。Western blot法检测42例新鲜鳞癌和癌旁组织中hOGG1蛋白的表达情况，发现38例鳞癌组织中hOGG1蛋白表达下降，这个结果与组化结果基本相一致，并且敏感性更好。免疫组化法检测食管鳞癌和癌旁组织中8-oxoG氧化损伤程度，结果显示：不同鳞癌患者组织中8-oxoG氧化损伤程度不同。食管鳞癌组织中8-oxoG的氧化损伤程度明显高于癌旁组织（t=16.32，P<0.001），并且鳞癌组织中的8-oxoG氧化损伤程度与hOGG1蛋白的表达呈负相关（x2=29.65，P<0.05，r=-0.66）。用TUNEL试剂盒比较鳞癌和癌旁组织中细胞凋亡的情况，发现不同鳞癌患者组织中细胞凋亡指数不同。高表达hOGG1的鳞癌组织，凋亡指数较hOGG1表达低的鳞癌组织明显降低（t=17.64，P<0.001），并且与hOGG1的表达呈负相关（x2=23.13，P<0.05，r=-0.583）。食管鳞癌组织中hOGG1蛋白的低表达与食管鳞癌静脉侵犯、淋巴结转移有相关性（P<0.005），与年龄、性别、病理分化程度无相关性（P>0.05）。由此推测，某种因素可能抑制了食管鳞癌组织中hOGG1蛋白的表达，hOGG1蛋白的低表达又影响了食管鳞癌组织中8-oxoG的修复，造成鳞癌组织中8-oxoG氧化损伤程度的增高和凋亡指数的升高，这些都加剧了食管鳞癌发生发展。另外，hOGG1蛋白在不同鳞癌患者的组织中的表达存在个体差异，这些差异是否影响术后化学治疗效果，将在后续的试验中进行探讨。
　　 2.为了研究食管鳞癌细胞hOGG1蛋白表达改变，与氧化剂和化疗药作用后，该细胞存活率、氧化损伤、凋亡指数改变的关系，本研究建立了hOGG1蛋白高表达的食管鳞状上皮癌细胞模型。即构建重组质粒 pENTR3C-hogg1，再将重组质粒与腺病毒载体pAd-CMV5-DEST进行同源重组，获得重组腺病毒pAd-CMV5-DEST-hogg1。重组腺病毒和空载体腺病毒pAd/CMV/V5-GW/lacZ分别转染293A细胞，分别得到高滴度的病毒液，经噬斑形成实验测定其滴度，再分别转染食管鳞癌细胞株EC9706。分别提取转染重组腺病毒的EC9706-hogg1细胞、转染空载体腺病毒的EC9706-lacz细胞以及未转染腺病毒的EC9706细胞蛋白，用western blot比较其中hOGG1蛋白的表达量，结果显示前者hOGG1蛋白的表达明显高于后两者，而未转染组及转染空腺病毒的细胞hOGG1蛋白的表达没有明显差别。
　　 3.H2O2可以作用于核内DNA，导致DNA链断裂和碱基损伤。用不同浓度H2O2作用EC9706-hogg1、EC9706-lacz、EC9706细胞，经不同时间，MTT法测得H2O2长时间作用细胞的最适作用浓度为65μM，再用该浓度的H2O2不同时间分别作用于三种EC9706细胞，MTT和台盼蓝染色实验显示，EC9706-hogg1细胞较另两种细胞有更高的存活率（P<0.05）；用不同浓度H2O2短时间作用EC9706细胞，8-oxoG染色测得H2O2作用的最适浓度及时间为1OOμM2h，再用该浓度及时间作用三种细胞，8-oxoG和TUNEL试剂盒染色显示，EC9706-hogg1细胞中8-oxoG氧化损伤程度和细胞的凋亡指数较均较EC9706-lacz和EC9706细胞降低。
　　 4.顺铂是广泛应用于恶性肿瘤的化疗药物，也是食管鳞癌化疗的常用药物之一。用不同浓度顺铂作用EC9706-hogg1、EC9706-lacz、EC9706细胞，经不同时间，MTT法测得顺铂长时间作用细胞的最适作用浓度为2mg/ml，再用该浓度的顺铂不同时间分别作用于三种EC9706细胞，经MTT和台盼蓝实验显示，EC9706-hogg1细胞较另两组细胞有更高的存活率（P<0.05）；用不同浓度顺铂短时间作用EC9706细胞，8-oxoG染色试得顺铂作用的最适浓度及时间为4μg/ml2h，再用该浓度及时间作用三种细胞，8-oxoG和TUNEL试剂盒染色显示，EC9706-hogg1细胞中8-oxoG氧化损伤程度和细胞的凋亡指数较均较EC9706-lacz和EC9706细胞降低。这些结果说明，当食管鳞状上皮癌细胞hOGG1蛋白表达高时，食管鳞癌细胞对氧化剂H2O2和顺铂类化疗药物的耐受性就增强。因此，术后常规对患者食管癌标本做hOGG1蛋白表达的检测，有助于指导食管鳞癌术后化学治疗方案的制定。

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