HLA基因分型方法的建立及HLAⅠ类基因与HBV感染相关性初步研究

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HLA (Human Leukocyte Antigen，HLA)是具有高度多态性和连锁不平衡的基因群。其多态性被证实与移植手术预后，强直性脊柱炎、多发性硬化等自身免疫疾病，与HIV、HCV等病毒感染性疾病以及自发性流产，妊高征等疾病有相关性。 HLA基因DNA水平的分型技术主要包括以下方法：PCR-RFLP，PCR-SSCP，PCR-SSO，PCR-SSP和PCR-SBT。PCR-SSO和PCR-SSP方法分别使用特异性的寡核苷酸探针和特异性引物分型，有着快速、简便、准确度高的优点，是目前最为常用的 HLA 分型方法。PCR-SBT方法是国际组织相容性工作组推荐的HLA基因分型技术。该方法重复性和精确度高，可直接获得详细的序列图谱，在确认其他方法所发现的新的HLA等位基因、研究HLA与疾病的相关性等方面有明显优势，是目前HLA高分辨率分型的最可靠方法。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是严重危害公众健康的全球性公共卫生问题。目前我国HBV携带者超过1亿。HBV感染后可有多种临床表现和转归：从隐匿性感染、无症状携带者、急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝硬化到原发性肝细胞癌等。这种临床表现的多样性不可避免地与宿主免疫反应的强弱、类型等有关。HLA在免疫应答的发生发展中发挥着关键作用，因此从控制和调节免疫反应的HLA分子入手，研究HBV感染后个体间不同临床转归的遗传易感性有重要意义。国内外就HLA多态性与HBV感染转归的相关性也进行了大量的研究，但结论差异较大，即使是同一地区的研究结果也存在重复性较差的问题。本研究以国际组织相容性工作组 (IHWG)推荐的 HLA-SBT 标准分型方法为依据，配合使用Lasergene Seqman软件和NCBI dbMHC数据库的SBT Input在线序列分析工具，建立了适合本实验室开展的HLA基因分型方法，并应用此方法对377例样本进行了HLA-A、-B和-C基因座位的分型。本次研究共成功分型HLA-A基因座位样本366份，HLA-B基因座位样本375份，HLA-C基因座位样本365份。由于PCR-SSP方法快捷、简便，本研究中设计特异性的引物对HLA-Bw4、HLA-Bw6、HLA-C1、HLA-C2和HLA-A*110101/1121N进行快速分型。在92例标本中比较了PCR-SSP分型方法与PCR-SBT方法。HLA-Bw4、Bw6的正确率分别为92.6％和94.5％，HLA-C1、C2的正确率分别为96.6％和97.0％，HLA-A*110101/1121N的正确率为100％。另外，本研究中使用PCR-SBT分型法，发现了2个新的HLA等位基因：HLA-Cw*12030102和HLA-A*9216，序列分别被递交到EMBL核酸序列数据库和GeneBank核酸数据库，获取号码(accession number)分别为AM412763和EF468681。这两个新等位基因已获得世界卫生组织命名法委员会(WHO Nomenclature Committee)的正式命名。以江苏地区 HBV 感染后不同转归个体343例为研究样本，其中肝癌组103例，肝硬化组66例，慢性乙肝组132例，HBV清除组42例。采用PCR-SBT的方法，在HLA高分辨率分型水平下研究了HLA-A、-B、-C基因座位等位基因多态性与肝癌组、肝硬化组、慢性乙肝组和HBV清除组的相关性。经统计分析，A*330301，B*5801/5811和Cw*030201/030202与HBV感染后清除相关，p 值分别为0.0142，0.0606和0.0344；A*110101/1121N和B*130201与HBV感染后清除呈负相关，p值分别为0.0013和0.0424。B*40G1与感染后慢性化相关，p值为0.0484。A*330301，Cw*030201/030202和Cw*120201/120202与肝癌的发生相关，p值为0.0513，0.0247和0.0349；B*150101G1 与肝癌发生呈负相关，p值为0.0133。另外，使用软件PyPop计算了HLA-A-B-C、HLA-A-B、HLA-A-C和HLA-B-C单位型在各组的频率。分析结果显示，单倍型A*3303:B*5801:Cw*0302，A*3303：B*5801，A*3303：Cw*0302，A*0201：Cw*0304和B*5801：Cw*0302与HBV感染后清除相关，P值分别为0.0690，0.0690，0.0371，0.0227和0.0630；单倍型A*1101:Cw*0702与HBV感染后清除呈负相关，P值为0.0294。单倍型B*4001:Cw*0702与感染后慢性化相关，P值为0.0197：单倍型A*2402：Cw*0702与感染后慢性化呈负相关，P值为0.0302。单倍型A*0207：B*4601与肝硬化的发生相关，P值为0.0335。本研究结果由于部分组样本量较小，各组间样本量不平衡，因此所获得的数据仅能提供参考。但是该结果为进一步扩大各组样本量及结合 KIR 分型结果，深入探讨 HBV 的遗传易感性奠定了坚实的基础。

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作者
姜伟;
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作者单位

东南大学;

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授予单位东南大学;
学科遗传学
授予学位硕士
导师姓名张建琼;
年度 2007
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类免疫遗传学;
关键词
HLAⅠ类基因; 基因分型; 乙肝病毒感染; 分型方法;

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