近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）（R）-专一性羰基还原酶基因的克隆与表达

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光学纯苯基乙二醇是液晶材料中重要手性添加剂和医药、农药及精细化工产品的重要手性中间体。本实验室已通过筛选得到一株可立体选择性转化外消旋体得到㈣-苯基乙二醇的菌株，近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)CCTCCM203011，并通过纯化得到催化其反应的(R)-专一性羰基还原酶((R)-specificcarbonylreductase，rCR)纯蛋白，本实验的目的就是在分子水平上对羰基还原酶基因(rcr)进行研究，为得到更高效的专一性酶类打下基础。首先以近平滑假丝酵母CCTCCM203011基因组为模板，以rCR蛋白测序结果为依据设计引物，PCR扩增得到rcr全基因片断，将rcr连接入pMD18-TVector得到测序质粒pT-rCR，测序得到rcr全基因序列全长1011bp，其编码的蛋白序列具有336个氨基酸残基，计算分子量为35.9kD。通过对rcr基因的序列分析，鉴定了其3个功能域，分别为Adhzinc锌离子结合域，NAD+_Binding辅酶结合域以及GroEslike折叠腔域，此结果与纯蛋白性质相符合；并构建rcr基因的系统进化树。构建表达质粒pTrc-rCR，并酶切检验；将pTrc-rCR转化大肠杆菌表达菌株，得到含目的基因的重组大肠杆菌E.coliJM109/pTrc-rCR；IPTG诱导重组蛋白的表达，SDS-PAGE分析得到重组蛋白表达条带；酶的活力测定显示E.coliJM109/pTrc-rCR/IPTG比活为0.294U/mg；其全细胞可还原α-羟基苯乙酮(α-hydroxyacetophenone)得到(R)-苯基乙二醇(97.5％e.e.，28％yield)。通过摇瓶条件的研究，确定了重组蛋白的最佳诱导条件为：250mL的三角瓶中装液量20％，最适培养温度30℃，诱导剂IPTG的浓度为1mmol/L，培养8hr开始诱导，诱导16hr结束培养。以重组菌全细胞催化不对称还原反应，确定了重组菌的最佳反应条件为：最适反应pH7.0，最适反应温度30℃，以湿细胞状态参加反应，反应转速150r/min，反应时间48hr。底物浓度2％0；在反应体系中添加0.5％乙醇对反应有很大的促进作用，产物(R)-苯基乙二醇的e.e.值＞98％，得率＞80％。

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作者
许娜;
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作者单位

江南大学;

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授予单位江南大学;
学科生物化工
授予学位硕士
导师姓名徐岩;
年度 2006
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类微生物生物化学;
关键词
羰基还原酶; 基因克隆; 不对称还原; (R)-苯基乙二醇; 近平滑假丝酵母; 基因工程;

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