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中药中多种真菌毒素同步检测及黄曲霉毒素B1快速检测新技术研究

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中药作为中医药不可缺少的一部分，其质量安全是中医药事业健康、持续发展的重要保障。近年来，中药因其独特的药用价值而被广泛应用，导致需求量不断增加。中药在种植、采收、加工、储藏等过程中污染的各种外源性有害物质，会影响中药的质量并对使用者产生潜在的危害。真菌毒素是现阶段影响中药安全性的最重要的外源性污染物之一，是由有害真菌产生的次级代谢产物，通过在体内蓄积损害肝、肾功能，甚至引发癌症，严重危害人体健康。因此，建立灵敏、快速、高通量的检测技术，对中药中真菌毒素的污染情况进行监控和预警，，对保证中药的质量、有效性和安全性具有重要意义。基于本论文主要研究内容和结论如下： 1.建立了免疫亲和柱净化-高效液相色谱-柱后光化学衍生-荧光检测法（IAC-HPLC-PCD-FLD）测定黄芪、远志等8种中药材中黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2含量。 通过对样品前处理及色谱条件的优化，建立了同时检测黄芪、远志等8种中药材中黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2污染水平的IAC-HPLC-PCD-FLD方法，并用于实际样品的检测。结果表明，4种黄曲霉毒素在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数R为0.9991-0.9996，检测限为1.25μg·kg-1，定量限为2.5μg·kg-1，平均加样回收率为 78.9%-111.8%。样品检测结果显示 1 批远志中检测出黄曲霉毒素，黄曲霉毒素的总量未超过 2015 年版《中国药典》[4]中对部分中药材中黄曲霉毒素总量的限量标准10 μg·kg-1；4批槟榔检出黄曲霉毒素，其中两批槟榔黄曲霉毒素 B1和黄曲霉毒素总量两项指标均严重超出限量标准。阳性样品检测结果经液相色谱-串联质谱法进一步确证，结果未发现假阳性，表明方法准确、可靠。 2.研究了中药饮片中黄曲霉毒素在加工过程中的转移规律。 中药在加工过程中真菌毒素的残留值得实时监测分析，以确保相关产品的质量也满足国际限量水平。选取黄芪和远志为研究对象，通过检测黄曲霉菌污染的中药饮片，以及采用该饮片制备的配方颗粒和煎煮滤渣中的黄曲霉毒素的含量，研究中药中黄曲霉毒素的转移规律，为污染中药安全性提供理论依据。研究结果表明，受到黄曲霉菌污染的中药饮片含有大量的黄曲霉毒素，其中主要以黄曲霉毒素 B1和 B2为主，部分含有黄曲霉毒素 G2。同时我们发现，由受黄曲霉菌污染的中药饮片制备的配方颗粒中同样含有相对应的黄曲霉毒素，而且转移率达18.4％至77.5％。此外，经过提取加工后的中药饮片残留的药渣中依旧含有大量黄曲霉毒素，尤其是含有高浓度黄曲霉毒素的饮片，由于黄曲霉毒素的水溶性较差，因此煎煮滤渣中保留了较大部分的黄曲霉毒素。因此对于受到黄曲霉菌污染的中药建议经过适当处理后再投入环境中，避免黄曲霉毒素对环境造成污染。 3.建立了超高压液相色谱-串联质谱（UFLC-MS/MS）法同时检测黄芪中21种真菌毒素。 通过对样品的提取溶剂、提取方法及色谱、质谱条件的优化，建立了可同时检测黄芪中21种真菌毒素（黄曲霉毒素B1（AFB1）、黄曲霉毒素B2（AFB2）、黄曲霉毒素G1（AFG1）、黄曲霉毒素G2（AFG2）、赭曲霉毒素A（OTA）、赭曲霉毒素B（OTB）、杂色曲霉毒素（ST）、青霉酸（PA）、HT-2毒素（HT-2）、T-2毒素（T-2）、伏马毒素B1（FB1）、伏马毒素B2（FB2）、伏马毒素B3（FB3）、环匹阿尼酸（CPA）、呕吐毒素（DON）、雪腐镰刀菌烯醇（NIV）、镰刀菌烯酮 X （Fus-X）、交链孢酚（AOH）、交链孢酚单甲醚（AME），腾毒素（TEN），玉米赤霉烯酮（ZEN））污染水平的UFLC-MS/MS方法，并用于实际样品的检测。通过优化的SPE净化方法处理样品溶液，结果显示，21种真菌毒素在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数 R 为 0.9995-1，检测限为 0.01 ng·mL-1~0.1 ng·mL-1，定量限为0.025 ng·mL-1~0.25 ng·mL-1，平均回收率为54.9-110.7%。在实际样品检测过程中发现经人工黄曲霉菌侵染的黄芪样品中检出了黄曲霉毒素（AFB1和AFB2），自然发霉的黄芪样品污染了赭曲霉毒素（OTA和OTB），其他真菌毒素未检出。该方法不仅能够缩短样品前处理时间、降低有机溶剂的使用量，还可以为高通量检测其他中药中多种真菌毒素提供参考。 4.基于非标记核酸适配体传感器和PicoGreen荧光染料检测中药材中的黄曲霉毒素B1。 利用核酸适配体对AFB1的高选择性和PicoGreen对痕量双链DNA的超灵敏度，建立了一种基于非标记核酸适配体传感器和PicoGreen荧光染料检测中药材中的黄曲霉毒素 B1的新方法，方法简便、快速，并且可实现复杂中药材基质中AFB1的检测。以 TE（Tris-EDTA，pH 8.0）缓冲液对样品提取液进行稀释，克服中药材中酸碱成分对检测的影响，同时采用基质匹配标准曲线对测定值进行校正，以确保检测结果的准确性。整个检测过程可以在 30 分钟内完成，当 AFB1的浓度为0.1-10μg·L-1（0.1-10 ppb），方法中检测的荧光强度（y）与AFB1浓度对数（Lgx）之间的良好线性关系，相关系数R为0.9905-0.9976。方法的回收率测定中AFB1浓度的添加水平为2.5，5和10μg·kg-1，检测结果分别为71.1-99.2%， 78.5-100.9%和79.4-100.4％。实际样品分析检测中，发现4批槟榔和1批麦芽检出AFB1，其中3批槟榔中含有的AFB1超出限量标准。 5.建立了荧光素标记核酸适配体传感器检测黄曲霉毒素B1的方法。 以荧光素（FAM）标记的核酸适配体作为荧光探针，建立了核酸适配体识别-荧光法检测黄曲霉毒素B1的新方法。核酸适配体与目标待测物AFB1结合时构象会发生变化，导致与其互补杂交的FAM标记短链DNA无法与适配体进行碱基互补配对，从而引起荧光信号发生变化，据此可实现对AFB1的定量检测。在微孔板包被亲和素浓度为50 mg·L-1，适配体浓度为50 nmol·L-1，FAM标记互补短链DNA用量为100 nmol·L-1，结合缓冲液为SSC柠檬酸缓冲液（750mM NaCl， 75mM 柠檬酸钠，pH 8.0），37℃反应 30 min 的条件下，该方法的线性范围为0.1-20μg·L-1；检出限为0.5μg·L-1；相对标准偏差为2.6%。本方法选择性良好，操作简单，为中药中AFB1的快速筛查提供了新的检测方法。

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