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基于酪酸梭菌1,3-丙二醇脱氢酶的基因工程菌构建与1,3-丙二醇的全细胞法生物合成

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1,3-丙二醇（1,3-propanediol, 1,3-PD）是一种重要的平台化学品，作为溶剂、抗冻剂，添加剂等广泛应用于食品、医药、化妆品、化工等领域。目前，1,3-PD可以通过化学和生物法合成，由于生物法在经济上具有潜在竞争性并且对环境友好而受到更多的关注。Clostridium butyricum作为益生菌并且含有不需要辅酶B12的甘油脱水酶（glycerol dehydratase, GDHt），是非常具有吸引力的1,3-PD生产菌株。微生物代谢甘油生物转化成1,3-PD时，1,3-丙二醇脱氢酶（1,3-propanediol dehydrogenase, PDOR）是合成途径中的关键酶，在生物法生产1,3-PD过程中起着重要的作用。有鉴于此，本研究在筛选并鉴定的一株 C. butyricum 的基础上，克隆其PDOR编码基因，构建PDOR的E. coli基因工程菌，并利用全细胞法研究C. butyricum和基因工程菌的混菌转化甘油生产 1,3-PD情况。取得的研究结果如下： （1）通过形态学、生理生化特征，初步筛选鉴定了 2 株 C. butyricum，分别为YJH-09和YJH-12。通过TA克隆获得16S rDNA片段序列，经分子生物学鉴定及构建系统发育树，确定了YJH-09和YJH-12的分类学地位。 （2）从筛选的C. butyricum中克隆了编码PDOR的dhaT基因，测序结果显示该基因序列全长为1158bp；利用无缝克隆技术构建了重组质粒pET-dhaT，在E. coli BL21(DE3)中成功表达了dhaT基因，重组PDOR经镍柱亲和层析与超滤纯化，获得清晰特征条带，分子量大小约为 46kDa。重组 PDOR 酶学性质测定结果显示：以丙醛为底物，还原反应的最适温度为37℃，最适pH为9.0，比活力为25.7 U/mg，对丙醛的Km为0.36 mM，Vmax为34.59 U/mg，对NADH的Km为0.019 mM，Vmax为21.47 U/mg；以1,3-PD为底物，氧化反应最适温度为30℃，最适pH为11.0，比活力为7.9 U/mg，对1,3-PD的Km为2.78 mM，Vmax为9.68 U/mg，对NAD+的Km为0.107 mM，Vmax为7.36 U/mg；不同的底物下，PDOR对一些醛、酮、醇类具有催化能力，其中PDOR对丙醛的还原活力最高，对1,3-PD的氧化活力最高。 （3）通过单因素实验优化了全细胞转化实验中影响1,3-PD产量的关键因素，得到最佳转化条件：底物甘油浓度为50g/L、C. butyricumYJH-09和BL21-pET-dhaT菌体比例为 1:1、外源 NADH 的浓度为 0.5mM。在以上优化条件下进行 C.butyricumYJH-09和BL21-pET-dhaT的全细胞混合转化，30h得到1,3-PD最高产量为25.88g/L，产率为0.54g/g。与原始菌C. butyricum YJH-09相比，1,3-PD产量提高了2倍多。

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