幽门螺杆菌Cag致病岛hp0540基因在其致病机制中的作用

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第一章绪论

1.1研究背景

1.1.1幽门螺杆菌感染的流行病学

1.1.2 H.pylori的致病机制

1.1.3幽门螺杆菌Cag致病岛

1.1.4 Ⅳ型分泌系统(type Ⅳ secretion system，T4SS)

1.2本研究的目的、内容与技术路线

1.2.1研究目的

1.2.2研究内容

1.2.3技术路线

第二章幽门螺杆菌hp0540基因的克隆及序列分析

2.1材料

2.1.1菌株和质粒

2.1.2主要试剂

2.1.3主要溶液的配制

2.1.4主要仪器

2.2方法

2.2.1 H.pylori的培养与鉴定

2.2.2 H.pylori基因组DNA的提取

2.2.3 PCR引物的设计

2.2.4 PCR反应

2.2.5目的DNA片段的回收

2.2.6感受态细胞的制备

2.2.7载体和目的片段的连接

2.2.8转化与筛选

2.2.9重组质粒的鉴定

2.2.10重组质粒中目的基因序列的检测

2.2.11 H.pylori NCTC11637菌株hp0540基因序列提交GenBank

2.2.12 H.pylori hp0540编码蛋白的理化特性及免疫原性预测

2.2.13登陆SMART数据库预测与CagI具有相互作用的蛋白

2.3结果

2.3.1 H.pylori的分离培养与鉴定

2.3.2 PCR法扩增H.pylori hp0540基因片段

2.3.3 TA克隆与鉴定

2.3.4 H.pylori NCTC11637菌株hp0540基因的测序结果

2.3.5 H.pylori菌株间hp0540基因同源性比较

2.3.6 hp0540编码蛋白的理化特性分析

2.3.7 hp0540编码蛋白的免疫表位分析

2.3.8与CagI具有相互作用蛋白的预测

2.4讨论

第三章幽门螺杆菌hp0540基因的原核表达及其抗体制备

3.1材料

3.1.1菌株和质粒

3.1.2主要试剂

3.1.3主要溶液配制

3.1.4主要仪器

3.2方法

3.2.1重组表达质粒的构建

3.2.2目的基因的诱导表达

3.2.3重组蛋白可溶性分析

3.2.4重组蛋白的纯化

3.2.5纯化产物的SDS-PAGE分析

3.2.6重组蛋白的复性、浓缩

3.2.7抗重组CagI蛋白抗体的制备及效价测定

3.3结果

3.3.1重组表达质粒的酶切鉴定

3.3.2不同IPTG浓度对目的蛋白表达的影响

3.3.3不同诱导时间对目的蛋白表达的影响

3.3.4目的蛋白的可溶性分析

3.3.5目的蛋白的纯化、复性及浓缩

3.3.6抗体效价测定

3.4讨论

第四章幽门螺杆菌hp0540基因的缺失及其对CagA蛋白转运能力的影响

4.1材料

4.1.1细胞、菌株与载体

4.1.2主要试剂

4.1.3主要溶液

4.1.4主要仪器

4.2方法

4.2.1细菌和细胞的培养

4.2.2自杀质粒同源片段的扩增

4.2.3自杀质粒pBlueKM402Δhp0540的构建

4.2.4 hp0540基因缺失株的构建

4.2.5 hp0540基因缺失株的鉴定

4.2.6 hp0540的缺失对CagA蛋白转运的影响

4.3结果

4.3.1 hp0540基因缺失自杀质粒的构建

4.3.2 hp0540基因缺失株的鉴定

4.3.3 hp0540基因缺失对CagA蛋白转运能力的影响

4.4讨论

第五章主要结论与展望

5.1主要结论

5.2主要展望

致 谢

参考文献

攻读硕士期间发表论文与参加课题