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【6h】

银杏叶提取物及其有效单体防治糖尿病肾病的作用及机制

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摘要

目的:
　　 1. 建立银杏叶提取物（GBE）血清药理学研究方法；
　　 2. 采用该方法研究GBE含药血清对肾小球系膜细胞（MC）的作用；
　　 3. 考察GBE中单体成分芦丁和槲皮素对MC的作用。
　　 方法:
　　 第一部分：GBE血清药理学方法的建立及其含药血清对MC的作用
　　 1.含药血清的制备：正常SD大鼠随机分成正常对照组、GBE高剂量组、GBE中剂量组、GBE低剂量组。连续给药，每日2次，于末次给药后采血。无菌条件下分离血清，滤过后冻存。
　　 2.大鼠MC的培养：大鼠MC分为正常对照组、空白血清组、高糖模型组、低、中、高剂量含药血清组、GBE对照组，体外常规培养。
　　 3.MTT法确定体系中最佳空白血清添加量。
　　 4.HPLC法结合药效法确定最宜采血时间。
　　 5.可见分光光度法测胞浆T-SOD、MDA、T-AOC三个抗氧化指标的水平。
　　 6.放射免疫法测细胞浆内Ⅳ型胶原和层粘蛋白含量。
　　 7.RT-PCR法测细胞TGF-β1mRNA表达。
　　 8.HPLC法测GBE及其含药血清指纹图谱。
　　 第二部分：GBE单体有效成分对MC的作用
　　 1.大鼠肾小球系膜细胞的培养。大鼠MC分为正常对照组、溶剂对照组、高糖模型组、GBE对照组、卡托普利对照组、低、高剂量芦丁组、低、高剂量槲皮素组。
　　 2.流式细胞术法测细胞周期。
　　 3.放射免疫法测胞浆内Ⅳ型胶原和层粘蛋白含量。
　　 4.RT-PCR法测TGF-β1 mRNA表达。
　　 5.免疫印迹法测Smad2/3、Smad7蛋白含量。
　　 6.可见分光光度法测胞浆T-SOD、MDA两个抗氧化指标的水平。
　　 结果:
　　 第一部分：GBE血清药理学方法的建立及其含药血清对MC的作用
　　 1.按人临床用药等效剂量的5倍，每日2次、连续4天灌胃给药，于末次给药后2 h采血时大鼠血清中GBE各有效成分的含量最高。
　　 2.体系中加入20％该条件下制备的含药血清对MC细胞正常增殖没有影响。
　　 3.与高糖组相比，中、高剂量组含药血清和GBE均可显著提高MC的抗氧化水平。高剂量组含药血清的抗氧化能力略好于GBE。
　　 4.与高糖组相比，GBE含药血清中、高剂量组和GBE组的Ⅳ型胶原有显著性下降；GBE高剂量含药血清组和GBE组的Ⅳ型胶原的表达水平相当；GBE含药血清低中、高剂量组和GBE组的层粘蛋白有显著性下降。
　　 5.与高糖组相比，GBE含药血清中、高剂量组和GBE组TGF-β1含量明显降低，有显著性差异。表明GBE含药血清可以降低TGF-β1的表达。
　　 6.在GBE及其含药血清指纹图谱中确定了芦丁、槲皮素、槲皮苷和山奈酚四种单体成分，其中芦丁和槲皮素是两种主要成分。
　　 第二部分：GBE单体有效成分对MC的作用
　　 1.与高糖组相比，芦丁低、高剂量组和槲皮素低、高剂量组的G0/G1期均有显著降低，不同剂量芦丁组S期细胞比例有不同程度的升高；与正常组比较，槲皮素组S期细胞百分率降低，但G2/M期细胞比例增多，高剂量槲皮素可引起凋亡。
　　 2.与高糖组相比，芦丁和槲皮素低、高剂量组均可降低细胞内Smad2/3蛋白的表达，增加细胞内Smad7蛋白的表达；芦丁高剂量组和槲皮素低、高剂量组层粘蛋白和Ⅳ型胶原的表达有显著性降低，与高糖组相比皆有显著性差异；芦丁和槲皮素低、高剂量组的TGF-β1mRNA的表达较高糖组显著性降低。
　　 3.与高糖组相比，芦丁和槲皮素低、高剂量组抗氧化能力均有不同程度提高，且槲皮素的抗氧化能力优于芦丁。
　　 结论:GBE含药血清及其有效单体芦丁和槲皮素均有很强的抗氧化和抗纤维化能力，能明显抑制高糖环境下TGF-β1/Smads信号异常所致的Ⅳ型胶原和层粘蛋白的大量表达。GBE对MC有显著保护作用。

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