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甜菜夜蛾和斜纹夜蛾触角酯酶及褐飞虱气味结合蛋白的基因克隆及功能研究

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第1章 文献综述

1．1 昆虫气味信号传导过程

1．1．1 周缘神经过程

1．1．2 中枢神经过程

1．2 昆虫气味结合蛋白的研究进展

1．2．1 气味结合蛋白的数量和分类

1．2．2 气味结合蛋白分子特征及其对气味分子的结合和释放机制

1．2．3 气味结合蛋白体外配体结合实验及体内功能研究

1．2．4 气味结合蛋白生理功能

1．3 昆虫气味降解酶的研究进展

1．3．1 气味降解酶的分类

1．3．2 触角淋巴液中可溶性酶

1．3．3 触角淋巴液中膜结合酶

1．3．4 胞内酶

1．3．5 表皮酶

1．4 昆虫酯酶分类及羧酸／胆碱酯酶作用机理

1．4．1 分类

1．4．2 羧酸／胆碱酯酶作用机理

1．5 本研究目的与意义

第2章 甜菜夜蛾触角酯酶基因的克隆、序列分析和表达谱研究

2．1 材料与方法

2．1．1 供试材料及材料收集

2．1．2 主要试剂和仪器设备

2．1．3 昆虫核酸提取

2．1．4 DNA第一链的合成

2．1．5 甜菜夜蛾转录组CXE同源搜索及引物设计

2．1．6 PCR扩增

2．1．7 RACE技术扩增CXE基因的cDNA全序列

2．1．8 PCR产物纯化、克隆和测序

2．1．9 甜菜夜蛾CXE基因的定量分析

2．2 结果与分析

2．2．1 甜菜夜蛾CXE基因cDNA片段的获得

2．2．2 甜菜夜蛾CXE基因cDNA全长及基因组DNA的克隆与分析

2．2．3 荧光定量PCR产物熔解曲线分析

2．2．4 甜菜夜蛾CXE基因的组织表达谱

2．2．5 甜菜夜蛾CXE基因表达的日动态

2．3 讨论

第3章 斜纹夜蛾触角酯酶基因的克隆、序列分析和表达谱研究

3．1 材料与方法

3．1．1 供试材料及材料收集

3．1．2 主要试剂和仪器设备

3．1．3 昆虫核酸提取

3．1．4 DNA第一链的合成

3．1．5 PCR引物设计

3．1．6 PCR扩增

3．1．7 RACE技术扩增CXE基因的cDNA全序列

3．1．8 PCR产物纯化、克隆和测序

3．1．9 斜纹夜蛾CXE基因系统发育分析

3．1．10 斜纹夜蛾CXE基因的定量分析

3．2 结果与分析

3．2．1 斜纹夜蛾CXE基因cDNA片段的克隆与分析

3．2．2 斜纹夜蛾CXE基因cDNA全长及基因组DNA的克隆与分析

3．2．3 斜纹夜蛾和甜菜夜蛾CXE系统发育分析

3．2．4 荧光定量PCR产物熔解曲线分析

3．2．5 斜纹夜蛾CXE基因的组织表达谱

3．2．6 斜纹夜蛾CXE基因表达的日动态

3．3 讨论

第4章 甜菜夜蛾和斜纹夜蛾触角酯酶的体外表达及蛋白纯化

4．1 材料与方法

4．1．1 主要试剂和仪器设备

4．2 甜菜夜蛾和斜纹夜蛾CXE基因真核表达供体质粒构建

4．2．1 引物设计

4．2．2 PCR扩增

4．2．3 PCR纯化产物纯化、克隆、测序

4．2．4 双酶切、连接、转化测序

4．2．5 重组杆状病毒质粒的构建

4．2．6 昆虫细胞的培养

4．2．7 重组病毒Bacmid DNA对昆虫细胞的的转染及感染

4．2．8 SDS-PAGE及Western杂交

4．2．9 重组酯酶的Native-PAGE鉴定

4．2．10 酯酶亲和纯化及超滤浓缩

4．3 结果与分析

4．3．1 重组杆状病毒Bacmid的获得

4．3．2 High-Five细胞被重组Bacmid感染后症状

4．3．3 Western杂交检测

4．3．4 CXE的α／β-乙酸萘酯的活性染色检测

4．3．5 SDS-PAGE分析

4．4 讨论

第5章 甜菜夜蛾和斜纹夜蛾触角酯酶的动力学参数测定

5．1 材料与方法

5．1．1 主要试剂和仪器设备

5．1．2 CXE对人工底物α-NA相对酶活力测定

5．1．3 CXE对天然酯类物质降解百分率测定

5．1．4 纯化的重组酯酶对天然酯类物质酶动力学测定

5．1．5 SexiCXE14对信息素混合物降解偏好性测定

5．1．6 不同pH条件下酶活力测定

5．2 结果与分析

5．2．1 CXE对α-NA的相对酶活力

5．2．2 CXE对不同酯类物质的降解活性

5．2．3 纯化重组酯酶的酶动力学参数

5．2．4 SexiCXE14对混合物中不同组分的偏好性

5．2．5 pH对酶活力的影响

5．3 讨论

第6章 利用表达序列标签对褐飞虱等昆虫气味结合蛋白基因的预测及验证

6．1 材料与方法

6．1．1 供试材料及材料收集

6．1．2 生物信息预测流程

6．1．3 主要试剂和仪器设备

6．1．4 昆虫核酸提取

6．1．5 DNA第一链的合成

6．1．6 RCR引物设计及Genbank登录号

6．1．7 PCR扩增

6．1．8 PCR产物纯化、克隆和测序

6．2 结果与分析

6．2．1 昆虫EST中的OBP预测

6．2．2 预测的OBP基因的PCR验证

6．3 讨论

第7章 褐飞虱气味结合蛋白的序列分析及表达谱研究

7．1 材料与方法

7．1．1 供试昆虫及材料收集

7．1．2 主要试剂和仪器设备

7．1．3 昆虫核酸提取

7．1．4 DNA第一链的合成

7．1．5 PCR引物设计

7．1．6 RACE技术扩增OBP基因的cDNA全序列

7．1．7 PCR产物纯化、克隆和测序

7．1．8 褐飞虱OBP基因的表达谱分析

7．1．9 数据统计分析

7．2 结果与分析

7．2．1 褐飞虱OBP基因cDNA全长克隆与分析

7．2．2 qPCR产物的熔解曲线和扩增效率分析

7．2．3 褐飞虱OBP基因表达谱的分析

7．3 讨论

第8章 褐飞虱气味结合蛋白的功能研究

8．1 材料与方法

8．1．1 供试材料及材料收集

8．1．2 主要试剂和仪器设备

8．1．3 昆虫核酸提取

8．1．4 DNA第一链的合成

8．1．5 PCR引物设计

8．1．6 原核表达载体的构建

8．1．7 重组蛋白的诱导表达

8．1．8 SDS-PAGE电泳分析

8．1．9 重组蛋白的纯化

8．1．10 褐飞虱OBP和气味物质的体外结合实验

8．1．11 dsRNA合成

8．1．12 dsRNA喂食实验及qPCR预测

8．1．13 “H”管双向选择生物测定

8．1．14 数据统计分析

8．2 结果与分析

8．2．1 褐飞虱OBPs体外表达和纯化

8．2．2 褐飞虱OBPs与气味物质结合能力

8．2．3 褐飞虱OBP3活体功能研究

8．3 讨论

全文总结

参考文献

附录：攻读博士学位期间学术论文的发表及参加学术会议

致谢

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摘要

在漫长的自然选择过程中，昆虫形成了非常精密的化学感受系统，得以从纷繁复杂的环境化学信号中，筛选并识别出与生命活动相关的信息，从而完成取食、交配、寻找产卵场、防御、种群密度调节等重要的行为和生理活动，研究昆虫化感机制具有重要的科学意义。从应用的角度看，害虫的防治长期以来依赖于化学农药，不但使害虫产生了抗性，同时农药残留给环境及人类安全带来重大隐患，因此急需更环保、更安全的害虫无公害防治新技术。而基于昆虫化学感受系统的行为调控技术，是害虫防治的重要组成并具有广阔的发展前景，深入研究害虫化学感受的分子机制，弄清化感相关蛋白基因及其功能，将有助于设计和开发更为高效的害虫行为调控技术。甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、斜纹夜蛾（Spodoptera litura）以及褐飞虱（Nilaparvata lugens）均是重要农业害虫，本文针对3种害虫的化感相关蛋白基因及其功能进行研究，主要结果如下:
　　 1.甜菜夜蛾触角酯酶基因的克隆、序列分析和表达谱研究通过兼并引物克隆和转录组数据分析，获得8个甜菜夜蛾触角酯酶(CXE)基因片段。进一步通过RACE技术获得其全长cDNA，其基因名称和Genbank登录号分别为SexiCXE5(HQ116561)、SexiCXE10(JF728805),SexiCXE11(JF728804)、SexiCXE13(HQ116560)、SexiCXE14(JF728803),SexiCXE17(HQ116559)、SexiCXE18(JF728802)和SexiCXE20(HQ116562)。对基因组DNA的克隆和分析发现，SexiCXE5含有10个内含子，其他7个SexiCXE各含有2个内含子。以实时定量PCR进行的表达量测定结果显示，SexiCXE10和SexiCXE17主要在触角中表达，其它组织中表达量很低;SexiCXE14除在触角中高表达外，在喙中也有较高表达;SexiCXE5和SexiCXE18以翅中的表达量最高;而SexiCXE11和SexiCXE13的表达量在检测组织中无明显差异。不同虫态(日龄)测定结果显示，8个SexiCX在雄成虫触角的表达量都高于末龄幼虫头部;SexiCXE5、SexiCXE10及exiCXE14的表达量从蛹末期（羽化前2天）到成虫3日龄持续上升，随后开始下降并维持较低水平;SexiCXE17则在1日龄（羽化当天）表达量最高，随后开始下降并维持较低水平;SexiCXE11和SexiCXE20在5日龄表达最高，其余日龄间无明显差异;SexiCXE13的表达量在不同日龄间无明显差异。
　　 2.斜纹夜蛾触角酯酶基因的克隆、序列分析和表达谱研究通过同源克隆技术，从斜纹夜蛾雄蛾触角扩增到3个触角酯酶(CXE)基因片段，进一步通过RACE技术获得cDNA全长，其名称和Genbank登录号分别为SlituCXE13(HQ116556)、SlituCXE17(HQ116558)和SlituCXE18(HQ116557)。以基因组DNA为模板进行扩增，发现SlituCXE13和SlituCXE18各含有2个内含子，SlituCXE17含有3个内含子。系统进化分析表明:SexiCXE14、SexiCXE17、SlituCXE17、SexiCXE18、SlituCXE18和SexiCXE20聚到A簇（线粒体、胞浆酶及分泌酯酶），SexiCXE10和SexiCXE11属于B簇（双翅目α-酯酶），SexiCXE5归于D簇（表皮酶与触角酶），SexiCXE13和SlituCXE13则在E簇（β-酯酶与信息素酯酶）。组织表达谱分析表明，SlituCXE17为触角高表达，SlituCXE18为翅高表达，SlituCXE13在各组织的表达量相似;就雄蛾触角中的表达量而言，3个基因中以SlituCXE13最高。日动态测定发现，3个SlituCXE基因在成虫触角的表达量都高于末龄幼虫头部;SlituCXE13在整个成虫期的表达比较平稳;而SlituCXE18从羽化后开始逐渐上升，到3日龄到达峰值，随后逐渐下降;SlituCXE17则在羽化当天达到高峰，随后下降并维持一定的表达。
　　 3.甜菜夜蛾和斜纹夜蛾触角酯酶基因的真核表达及纯化分别构建11个CXE基因的昆虫病毒表达载体pFastBac(1)的供体质粒，并利用High-Five昆虫细胞系进行体外大量表达。蛋白杂交结果表明，所有触角酯酶基因都成功表达，因为转染细胞的细胞裂解液在60 kDa左右均出现目标条带;同时，转染S exiCXE10和SexiCXE14的细胞上清中也出现目标条带，说明这两个基因的表达产物可以分泌到细胞外。利用酯酶人工底物α/β-乙酸萘酯混合物进行活性染色检测，表明，所表达的酯酶均具有生物活性。利用粗酶液对20种酯类气味物质进行活性测定，发现SexiCXE10、11、13、14和SlituCXE13至少可以降解一种酯类气味物质。然后，利用Ni-NTA亲和层析柱对这5种粗酶液进行纯化，SDS-PAGE检测表明纯化后的酶蛋白在60 kDa左右出现特异条带，纯度都在95％以上。
　　 4.甜菜夜蛾和斜纹夜蛾触角酯酶的底物活性及酶动力学测定为明确CXE在酯类性信息素组分等感受中的功能，首先比较了不同组织粗提液对酯类组分的活性，发现雄虫触角的粗提液较其它组织的粗提液，能更有效地降解同种雌虫的酯类性信息素组分。进一步研究表明，甜菜夜蛾雄蛾触角粗提液对供试所有酯类组分均具有活性，且活性随底物碳原子数的减少而增高（乙酸叶醇酯除外）。SexiCXE14纯酶和触角粗酶液所得结果相似，但SexiCXE10只对≤12个碳的酯类物质有活性（乙酸叶醇酯除外）。两种昆虫的直系同源基因产物SexiCXE13和SlituCXE13，对性信息素的降解能力在被测酯酶中最强;两种酶对苯甲酸苯甲酯和顺3-己酸己烯酯无活性，但对7个碳和8个碳的酯类物质的活性较高，降解率在85％以上。SexiCXE11对所测酯类物质的降解率基本在50％以下。酶动力学参数测定表明:SexiCXE13、SexiCXE14以及SlituCXE13均对自身性信息素的亲和力最高;而SexiCXE10对酯类性信息素没有明显活性，对普通酯类气味活性较高，其中对乙酸叶醇酯的亲和力最强。当两种酯类性信息素组分同时存在的时候，相比甜菜夜蛾性信息素次要组分Z9-14: Ac，SexiCXE14更偏好降解主要组分Z9E12-14:Ac。不同pH条件下相对酶活力测定表明:SexiCXE13、SexiCXE14在pH6.5时酶活力最高;而SexiCXE10从pH6.5到9.0酶活力仍然保持缓慢上升。综合分析认为，SexiCXE10是普通气味降解酯酶，只参与降解普通酯类气味物质;SexiCXE14是双功能降解酯酶，不仅降解酯类性信息素,同时参与降解普通酯类气味物质;而SexiCXE11、SexiCXE13和SlituCXE13是表皮酯酶，主要起到清除吸附到虫体表面的酯类气味的作用，由此降低背景噪音、提高嗅觉的灵敏性。
　　 5.褐飞虱气味结合蛋白基因的预测、克隆和序列分析昆虫气味结合蛋白Odorant Binding Protein(OBP)在气味的感受中具重要作用，但在褐飞虱这一重要农业害虫中尚未见报道。序列表达标签Express sequence tag(EST)数据库的不断丰富，为发现新的OBP基因提供了有利的平台。本文利用公共数据库National Center for Biotechnology Information(NCBI)的EST数据，从褐飞虱等57种昆虫的752，841条EST中发现142个OBP基因，其中117个属新发现基因，包括3个褐飞虱OBP新基因。在117个新发现的OBP基因中，88个具有完整的开放阅读框。随机选择来自8种昆虫的26条OBP序列进行PCR验证，22条OBP基因得以验证，成功率达85％，说明了预测方法的可靠性。
　　 6.褐飞虱气味结合蛋白的序列分析及表达谱研究基于褐飞虱的3个OBP片段，进一步通过RACE技术克隆到cDNA全长。3个褐飞虱OBP（NlugOBP）分别编码173、143和147个氨基酸，都具有典型OBP(ClassicOBP)的序列特征，并与其它昆虫的同源基因有较高的相似性，但3个NlugOBP之间的相似性较低。利用qRT-PCR检测了3个NlugOBP在若虫不同龄期、成虫不同性别、翅型及组织间的相对表达量。NlugOBP1的表达量在成虫和若虫间没有明显差异，但NlugOBP2在成虫期显著高于若虫期，NlugOBP3则在若虫期（5龄除外）显著高于成虫期;雌雄虫相比较发现，NlugOBP2和NlugOBP3不管在长翅和短翅型成虫中均以雌虫表达较高，而NlugOBP1在雌雄间无明显差异;3个NlugOBP在长短翅型成虫间均无明显差异;就不同组织而言，NlugOBP2在触角中高表达，在其他组织中很低;NlugOBP1除在触角高表达外，在翅中也有一定的表达;而NlugOBP3不仅在触角高表达，在腹部也有较高的表达。3个OBP明显不同的表达特征，暗示其在功能上存在差异。
　　 7.褐飞虱气味结合蛋白基因功能研究首先利用大肠杆菌表达系统大量获得了褐飞虱OBP重组蛋白，然后通过荧光竞争结合实验，测定了NlugOBP重组蛋白对不同结构气味物质的结合能力。结果表明，3个NlugOBP均以酮类和萜烯类气味物质的结合能力较高;3个NlugOBP相比较，NlugOBP3具有更宽的气味结合谱和更高的结合能力。通过对水稻挥发物的结合能力分析，并结合前期的表达量测定结果，推测NlugOBP3在褐飞虱对水稻气味的嗅觉中较另2个NlugOBP更为重要，因此进一步通过dsRNA喂食法对NlugOBP3进行RNA干扰研究。结果发现，dsRNA处理组褐飞虱NlugOBP3的表达量被显著抑制，处理后1天和2天时较对照组分别降低约60％和80％;同时，处理组褐飞虱对水稻植株的趋性显著降低，证实了NlugOBP3在褐飞虱感受水稻气味中的作用。此外还发现，dsRNA处理组褐飞虱的死亡率大幅度提高，说明NlugOBP3还具有嗅觉以外的生理功能。因此，NlugOBP3作为靶标基因，对于开发褐飞虱的行为调控和致死技术具有重要的利用价值。
　　 综上所述，本文综合运用分子生物学、生物化学和行为学分析技术，克隆了甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的11个触角酯酶基因以及褐飞虱的3个气味结合蛋白基因，测定了这些基因的时空表达特征，并深入研究了这些基因的功能。研究结果为弄清3种昆虫的气味感受机制，以及开发新型、高效的害虫行为调控技术提供了重要依据。

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