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昆虫病原线虫新属崇明拟异小杆线虫及其共生菌新种嗜线虫沙雷氏菌的系统分类

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目录

文摘

英文文摘

符号及缩略词对照表

第一章 昆虫病原线虫及其共生菌系统分类学研究进展

一、昆虫病原线虫的起源

二、昆虫病原线虫的生活史

三、昆虫病原线虫的分类

3.1 分类现状

3.2 斯氏科的分类[41]

3.3 斯氏线虫属形态回顾[41]

3.4 新斯氏线虫属形态[44]

3.5 异小杆科的分类[45]

3.6 异小杆科形态回顾[45]

四、昆虫病原线虫的分类方法

4.1 形态分类法

4.2 分子生物学分析法

4.3 结合杂交法

五、昆虫病原线虫共生菌的分类

5.1 共生菌分类概况

5.2 致病杆菌属(Xenorhabdus)的分类

5.3 发光杆菌属(Photorhabdus)的分类

5.4 共生菌分类研究展望

六、昆虫病原线虫致病性机制

6.1 破坏宿主的防御机制

6.2 破坏宿主的血淋巴

6.3 由线虫和共生细菌产生的毒素和次级代谢物

参考文献

第二章 崇明拟异小杆线虫DZ0503CMFT的分离鉴定

一、材料和方法

1.试验材料

2.线虫分离

3.线虫形态观察

4.线虫分子鉴定

二、结果与分析

1.线虫DZ0503CMFT形态测定

2.光学显微镜及SEM下线虫DZ0503CMFT形态观察

3.线虫DZ0503CMFT系统发育分析

三、讨论及新分类单元描述

1.讨论

2.新分类单元描述

本章小结

参考文献

第三章 嗜线虫沙雷氏菌DZ0503SBS1T的分离鉴定

一、材料和方法

1.供试菌株和培养基

2.形态观察

3.生理生化性状和碳源利用分析[4]

4.其他生理生化性状的测定[1]

5.数值分类法[4]

6.细胞脂肪酸分析

7.G+C mol%含量测定

8.待测菌株和参比菌株的DNA-DNA杂交[8,9,10]

9.16S rDNA以及RNA聚合酶β亚基序列测定及系统进化分析

二、结果与分析

1.菌体形态观察

2.生理生化性状和碳源利用分析

3.其他生理生化性状

4.数值分类法

6.G+C mol%含量测定结果

7.DNA-DNA杂交

8.16S rDNA以及rpoB基因序列系统发育分析

三、讨论及新种描述

1.讨论

2.新分类单元描述

本章小结

参考文献

第四章 崇明拟异小杆线虫及嗜线虫沙雷氏菌对大蜡螟的致病性

一、材料和方法

1.试验材料

2.试验方法

二、结果与分析

2.1 前端的中肠作为共生细菌存的特殊器官

2.2 崇明拟异小杆线虫对大蜡螟幼虫的致病性

2.3 崇明拟异小杆线虫与嗜线虫沙雷氏菌共生关系

本章小结

参考文献

全文总结

创新之处

攻读博士学位期间发表和录用的论文及申请专利

攻读博士学位期间获奖情况

附录Ⅰ

附录Ⅱ 本研究用到的相关线虫类别

附录Ⅲ

致谢

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摘要

昆虫病原线虫(Entomopathogenic nematodes, EPN)是20世纪发展起来的一种有潜能的、安全的生物防治因子,由于昆虫病原线虫寄主范围广泛,对土栖性及钻蛀性害虫与隐蔽性害虫有特殊防效,对人畜安全,不会污染环境,亦不会产生抗性,且能以低成本大规模生产、使用方便、杀虫速度快、并能与化学杀虫剂混用,因此已广泛应用于防治农林及牧草等害虫,受到众多学者及商业部门的高度重视。现已描述的昆虫病原线虫共有约77种,分别是异小杆科(Heterorhabditidae)中唯一的属异小杆属(Heterorhabditis)14种,斯氏科(Steinernematidae)的斯氏属(Steinernema)61种与新斯氏属(Neosteinernema)1种以及小杆科(Rhabditidae)拟异小杆线虫属(Heterorhabditidoides)1种,所有描述的昆虫病原线虫都属于小杆目。在其肠道内分别与肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的致病杆菌属(Xenorhabdus)细菌、发光杆菌属(Photorhabdus)细菌以及沙雷氏属(Serratia)细菌相互共生。其中拟异小杆属崇明拟异小杆线虫(Heterorhabditidoides chongmingensis)及其共生菌嗜线虫沙雷氏菌(Serratianematodiphila)是本研究描述的昆虫病原线虫及其共生菌新种嗜线虫沙雷氏菌。
   利用大蜡螟幼虫诱捕的方法从上海崇明岛采集的土样中分离到一个昆虫病原线虫新品系,标记为DZ0503CMFT。线虫DZ0503CMFT的体长:0.8-2.2 mm;线虫的表皮有环纹;口大约是头宽的1-1.5倍,口有厚壁,角皮化;唇口腔壁角皮化;存在较长的食管领,有中间食道球;雄成虫:交合刺长=51(37-68)μm;D%=107; SW=1.95;雄成虫粘液囊蝴蝶状,上面有9对生殖乳突,排列方式为1、2、3、3,在雄虫末端的排列方式及数目不变;交合刺不融合,稍向腹面弯曲;雌成虫:生殖腺成对;阴道外没有表皮覆盖,尾部通常有1-6个感受器;雌成虫尾部圆锥形或稍尖;侵染期线虫:体长=428(395-474)ìm; EP=90(80-105)μm; ES=104(92-120)μm;带鞘尾长111(89-159)μm; a=19.1(15-21); E%=83(67-97);线虫DZ0503CMFT形态结构特征与小杆科的小杆线虫属、小杆属、秀丽小杆属、幽灵杆属、大杆属有明显区别,与已描述的昆虫病原线虫异小杆科异小杆属也有明显区别。18S rDNA和ITSrDNA基因系统发育树证明线虫DZ0503CMFT是单系群,是小杆科已描述其它属的姊妹群.线虫DZ0503CMFT核酸中ITS1区域的A, T, C和G的百分比与异小杆属和小杆科已描述属有显著不同,结合昆虫病原线虫DZ0503CMFT不同发育时期的形态结构与分子系统进化特性分析,最终确定为小杆科中一个新属,根据国际动物命名原则,将昆虫病原线虫DZ0503CMFT命名为崇明拟异小杆线虫(Heterorhabditidoides chongmingensis)。
   通过碾碎100条表面消毒的侵染期崇明拟异小杆线虫或是取被崇明拟异小杆线虫侵染了24-48小时的大蜡螟血淋巴涂布于营养溴汾蓝平板鉴别培养基上,从崇明拟异小杆线虫肠道中分离到一株细胞和菌落形态以及保守性16S rDNA和rpoB基因与它相邻的模式菌株具有差别的新菌株,标记为DZ0503SBS1T。新分离菌株DZ0503SBS1T在营养琼脂上呈红色,革兰氏染色反应呈阴性,能运动,有荧光,菌体短杆状,单鞭毛。通过16S rDNA以及rpoB基因分析显示细菌为沙雷氏属,16SrDNA与日本朔沙雷菌JCM11315T,粘质沙雷菌DSM30121T,尿素水解沙雷菌LMG22860T序列相似性分别为99.8%、99.5%、98.3%; rpoB基因与以上菌株的相似性分别为98%,97.4%和98.3%。菌株DZ0503SBS1T与日本朔沙雷菌JCM11315T,粘质沙雷菌DSM30121T,尿素水解沙雷菌LMG22860, T DNA-DNA杂交结果分别为68.2%,65.1%,53%。DZ0503SBS1T主要脂肪酸为十六碳饱和脂肪酸(34.76%),环式十七碳饱和脂肪酸(20.03%)和ω8c-环式十九碳饱和脂肪酸(17.24%)。通过对新分离菌株DZ0503SBS1T形态学、细胞化学成分、生理生化和16S rDNA以及ipoB基因系统发育等多相指标分析,最终确定新分离菌株DZ0503SBS1T的分类学地位为沙雷氏菌属中一个新种,将其命名为嗜线虫沙雷菌(Serratianematodiphila)。
   用荧光显微镜对活体崇明拟异小杆线虫进行观察,发现其前端的中肠作为共生细菌储存的特殊器官。崇明拟异小杆线虫侵染大蜡螟幼虫后,可以在昆虫宿主的血淋巴内分离到共生菌嗜线虫沙雷氏菌,嗜线虫沙雷氏菌在昆虫宿主的死亡过程中起着重要的作用,具有较强的致病性,大约300个细菌就可以致死大蜡螟幼虫,并且嗜线虫沙雷氏菌对于崇明拟异小杆线虫的繁殖、生长、发育都有明显促进作用。

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