不同底物下瘤胃微生物的发酵特性及细菌菌群变化的分子描述

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瘤胃微生物区系主要由瘤胃细菌、古菌、原虫和真菌组成。相对细菌而言，真菌数量少，繁殖慢，在瘤胃这个复杂的生态系统中无疑处于劣势。但经数百万年的演化，瘤胃真菌和瘤胃细菌能共存于同一系统中，这不仅与瘤胃的生理特点有关，还与瘤胃真菌的底物利用特性及与其它微生物的营养互作有关。为此，本试验集中研究了不同底物(不同木质素含量底物和不同精粗比底物)下瘤胃真菌和细菌的发酵特性及菌群变化。试验共分6部分进行。 1瘤胃厌氧真菌和细菌对木质素含量不同底物的发酵特性研究体外发酵法研究了瘤胃厌氧真菌和细菌对木质素含量不同底物(黑麦草叶、黑麦草茎、稻草秸、花生壳，木质素含量依次上升)的发酵特性。结果表明：瘤胃厌氧真菌体外发酵不同底物时的96h累计产气量、底物干物质消失率和纤维素消失率差异均不显著，瘤胃细菌体外发酵时的干物质消失率和纤维素消失率均随底物木质素含量的上升而显著下降(P＜0.05)。此外，各真菌培养组中，稻草秸组96h发酵液中的木聚糖酶酶活显著高于黑麦草叶和黑麦草茎(P＜0.05)，发酵相同底物时，真菌产生的木聚糖酶酶活是羧甲基纤维素酶酶活的23-65倍。各细菌培养组中，黑麦草叶和黑麦草茎96h发酵液中的木聚糖酶和羧甲基纤维素酶酶活显著高于稻草秸(P＜0.05)。 2厌氧真菌对木质素含量不同底物的附着及降解特性的研究结合体外发酵和瘤胃尼龙袋法，研究了瘤胃厌氧真菌对木质素含量不同底物(黑麦草叶、黑麦草茎、稻草秸、花生壳，木质素含量依次上升)的附着及降解特性。结果表明：随体外发酵的进行，真菌数量逐渐增加，以黑麦草叶、黑麦草茎、稻草秸为底物时，瘤胃真菌数量均在48h达到最大值，且真菌数量的最大值随底物木质素含量的上升呈下降趋势。显微观察显示，体外发酵前72h附着于稻草秸表面孢子囊数量均显著高于黑麦草叶和黑麦草茎(P＜0.05)，而附着于黑麦草叶、黑麦草茎和稻草秸切缘的孢子囊数量差异不显著。瘤胃内培养结果表明，稻草秸切缘和表面孢子囊数量均在48h时最大，72h后数量显著下降(P＜0.05)，而黑麦草茎切缘和表面上的孢子囊数量均在24h时最大，72h后数量显著下降(P＜0.05)；稻草秸切缘和表面上子囊数量均在24h时最大，72h后数量显著下降(P＜0.05)；稻草秸切缘和表面上孢子囊数量均要高于黑麦草茎上的数量。不同底物进行厌氧真菌体外发酵时其干物质消失率差异均不显著，但在瘤胃内培养时，各底物的干物质消失率则随底物木质素含量的上升而显著下降(P＜0.05)。 3DGGE结合16SrDNA序列分析研究附着于不同底物的山羊瘤胃细菌区系组成和动态变化采用PCR/DGGE结合16SrDNA序列分析方法，研究了附着于不同底物(黑麦草叶、黑麦草茎和稻草秸)的山羊瘤胃细菌区系的组成和动态变化。结果表明，瘤胃内培养10min到6h附着于底物的瘤胃细菌DGGE图谱相似性很高，但是12h后附着于底物的细菌DGGE图谱发生了剧烈的变化，9条位于DGGE图谱中下部的共有条带消失，DGGE图谱上部出现3条新的条带。各时间点附着于黑麦草叶、黑麦草茎和稻草秸的瘤胃细菌DGGE图谱相似。序列分析结果表明，72个克隆中，有2个克隆与GenBank中已知序列的相似性大于97％，其余均低于97％。系统进化分析表明，附着于底物的瘤胃细菌从功能上主要可分为纤维降解细菌和丁酸产生菌。从分类上，这些细菌主要属于厚壁菌门和拟杆菌门，分别占总克隆数的64.2％和14.1％。 4不同精粗比底物下瘤胃厌氧真菌体外发酵特性及其对粗料的附着研究体外发酵法研究了不同精粗比底物下(A组为全粗料，B组3∶7，C组5∶5，D组7∶3，E组为全精料)瘤胃厌氧真菌体外发酵特性及其对粗饲料(稻草秸)的附着。结果表明，随精料比例的增加，真菌数量呈上升趋势，发酵48h达到最大值。发酵前期(24h)，精料组(B组、C组和D组)附着于稻草秸表面的真菌孢子囊数显著高于粗料组(A组)。发酵48h时各组附着于稻草秸表面的孢子囊数达到最大值。发酵后期(72h)D组和E组附着于稻草秸表面和切缘的孢子囊数显著下降，A组和B组附着于稻草秸表面和切缘的孢子囊数无显著变化。此外，随精料比例的增加，发酵96h的累计产气量显著上升(P＜0.05)，羧甲基纤维素酶和α-淀粉酶酶活呈上升趋势，木聚糖酶酶活呈下降趋势。 5不同精粗比底物下瘤胃真菌和纤维降解细菌共培养发酵特性及菌群变化采用体外厌氧共培养技术，研究了不同精粗比(A组为全粗料，B组3∶7，C组5∶5，D组7∶3，E组为全精料)底物下瘤胃真菌和纤维降解细菌共培养发酵特性及菌群变化。结果表明：与0h相比，发酵至24h时B组和C组的厌氧真菌数量有较大幅度的上升，A组和D组则有所下降，E组未检测到真菌生长；纤维降解细菌随精粗比的增加呈上升趋势。发酵至48h时，各组均未检测到真菌生长；从A组到C组细菌数量呈上升趋势，此后急剧下降。DGGE结果表明，A、B和C组(精粗比低于5∶5)的DGGE图谱相似，有11根共有条带，但是当精粗比上升到7∶3时，条带数目显著下降。随精料比例的增加，整个发酵期共培养系统中pH值显著下降(P＜0.05)。整个发酵期间，共培养系统发酵产生的VFA主要为乙酸，丙酸和丁酸的量较少，乙酸与丙酸比值从A组到C组呈下降趋势，此后呈上升趋势。随精料比例的上升，发酵48h时总挥发性脂肪酸浓度从A组到C组呈上升趋势，此后呈下降趋势。发酵48h的羧甲基纤维降素酶和木聚糖酶活均以A组最高，而α-淀粉酶酶活从A组到D组逐渐增大，而E组最低，仅为B、C、D组的1/4-1/3。 6日粮精料水平逐渐提高条件下山羊瘤胃发酵特性及细菌区系的变化研究了随日粮精料水平的逐渐提高，山羊瘤胃发酵特性及瘤胃细菌区系的变化。试验分四期进行，即Ⅰ期为全粗料，Ⅱ期到Ⅳ期精粗比依次为3∶7、5∶5和7∶3。结果表明，饲喂全粗料到精粗比5∶5日粮前期，随日粮精料比例的增加，瘤胃总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度呈上升趋势。饲喂精粗比5∶5日粮12天后TVFA浓度开始下降。随日粮精料比例的上升，丙酸比例呈上升趋势，乙酸比例和乙酸与丙酸比值呈下降趋势。饲喂全粗料到精粗比5∶5的日粮时，丁酸比例随日粮精料比例的增加呈上升趋势，但饲喂精粗比为7∶3的日粮后开始下降。DGGE结果表明，日粮由全粗料转为精粗比为3∶7时，瘤胃细菌区系变得更加复杂多样，日粮精粗比由3∶7转为5∶5时，山羊瘤胃细菌区系保持相对的稳定。日粮精粗比由5∶5转为7∶3时，瘤胃pH值迅速下降到5.36，饲喂三天后pH值下降到4.67，DGGE图谱上的条带数目急剧下降，瘤胃细菌区系发生了剧烈的变化，多种瘤胃纤维降解细菌和丁酸产生菌消失，细菌区系变得相对简单，牛链球菌和普雷沃菌成为瘤胃内的优势菌。此外，饲喂精粗比低于5∶5的日粮时，山羊瘤胃细菌区系的昼夜波动很小。

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作者
孙云章;
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作者单位

南京农业大学;

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授予单位南京农业大学;
学科预防兽医学
授予学位博士
导师姓名朱伟云;
年度 2005
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正文语种中文
中图分类家畜微生物学（兽医病原微生物学）;微生物生态学和地区分布;
关键词
瘤胃厌氧真菌; 瘤胃细菌; 体外发酵法; 细菌菌群; DGGE;

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