鱼藤酮诱发ROS抑制mTOR介导S6K1和4e-BP1通路导致神经细胞凋亡及调控机理研究

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本文运用细胞培养、荧光染色、RNA干扰、Western blotting等细胞学分子生物学技术，以PC12细胞和原代神经元为实验对象，综合研究了鱼藤酮诱导神经细胞ROS涉及的mTOR信号通路功能状态与细胞凋亡的关系及调控机理;发现并论证了鱼藤酮诱发ROS/H2O2并以caspase依赖和非依赖机制导致神经细胞凋亡，且阐明了鱼藤酮诱ROS在抑制mTOR介导S6K1和4E-BP1通路中的作用;最后，探讨了鱼藤酮对神经细胞NOX2及其调节蛋白表达影响及雷帕霉素调控作用。具体结果如下:
　　1、鱼藤酮诱发ROS/H2O2导致神经细胞凋亡
　　PC12细胞和原代小鼠大脑皮层神经元用0-1μM鱼藤酮处理24 h、或用1μM鱼藤酮处理0-24 h、或用过氧化氢酶(CAT)预处理1h后暴露0.5和1μM鱼藤酮24 h。采用One solution法检测细胞活性、DAPI和TUNEL染色评估细胞凋亡、ROS探针CM-H2DCFDA和H2O2特异性探针H2DCFDA荧光显色分析细胞内ROS和H2O2强度变化。结果显示，鱼藤酮以浓度和时间依赖的方式诱发神经细胞ROS高涨、细胞活性随ROS升高呈明显对应下降，细胞凋亡随ROS升高而逐渐触发;CAT明显抑制鱼藤酮诱导的神经细胞ROS升高，并与之对应削弱了鱼藤酮诱导的神经细胞活性下降和凋亡发生，确认鱼藤酮诱导的ROS成分是H2O2。提示:鱼藤酮通过氧化应激ROS/H2O2诱发神经细胞凋亡，调控神经细胞ROS水平、给予抗氧化剂（如:CAT）可以作为防止鱼藤酮诱导的神经变性疾病开发利用。
　　2、鱼藤酮诱发ROS/H2O2抑制mTOR介导S6K1和4E-BP1通路导致神经细胞凋亡实验选择PC12细胞和小鼠大脑皮层原代神经元为研究对象，用0-1μM鱼藤酮处理24 h、或用1μM鱼藤酮处理0-24 h、或用过氧化氢酶(CAT)预处理1h、或分别构建腺病毒过表达的Ad-mTOR-wt，持续激活S6K1的Ad-S6K1-ca和慢病毒干扰下调的shRNA4E-BP1的PC12细胞和原代神经元，暴露0.5和1μM鱼藤酮24 h。采用One solution分析细胞活性、DAPI染色评估细胞凋亡、ROS荧光探针CM-H2DCFDA分析细胞内ROS水平、Western blotting检测mTOR通路以及caspase通路中蛋白表达。结果显示，鱼藤酮浓度和时间依赖地抑制mTOR、S6K1、4E-BP1磷酸化;CAT明显削弱鱼滕酮这种抑制作用，暗示鱼藤酮诱发ROS/H2O2导致mTOR介导S6K1和4E-BP1通路抑制。与对照相比，过表达mTOR、持续激活S6K1或下调4E-BP1均能抵抗鱼藤酮诱导细胞活性下降或细胞凋亡表现，尤其发现它们均可以明显地减少ROS生成。提示:鱼藤酮诱发ROS/H2O2抑制mTOR介导S6K1和4E-BP1通路导致神经细胞凋亡。抗氧化剂或调控神经细胞mTOR信号中关键分子如mTOR、S6K1和4E-BP1的表达活性可为防止鱼藤酮诱导的神经变性疾病应用。
　　3、鱼藤酮诱发ROS/H2O2以caspase依赖和非依赖途径导致神经细胞凋亡
　　以PC12细胞和原代神经元为研究对象，用0-1μM鱼藤酮处理24 h、或用1μM鱼藤酮处理0-24 h、或在用过氧化氢酶(CAT，350 U/ml)和caspase抑制剂zVAD-fmk(100μM)分别预处理神经细胞1h和2h后暴露0.5和1μM鱼藤酮24 h、或分别构建腺病毒过表达的Ad-mTOR-wt，持续激活S6K1的Ad-S6K1-ca和慢病毒干扰下调的shRNA4E-BP1的PC12细胞和原代神经元在用zVAD-fmk分别预处理细胞2h后暴露1μM鱼藤酮24 h。采用Western blotting检测凋亡蛋白caspase-3及其下游PARP蛋白表达;DAPI染色分析细胞核断裂和核浓缩评估神经细胞凋亡状态。我们观察到，鱼藤酮以浓度和时间依赖方式增加神经细胞Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP表达，CAT有力地削弱这种表现;实验发现zVAD-fmk虽然可以显著地抑制Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP表达，但它仅部分地保护鱼藤酮导致神经细胞凋亡。此外，我们也注意到过表达mTOR、持续激活S6K1或下调4E-BP1分别联合zVAD-fmk处理细胞比单独用过表达mTOR、持续激活S6K1、下调4E-BP1或zVAD-fmk处理细胞更能抑制鱼藤酮诱导的神经细胞凋亡。提示:鱼藤酮诱发ROS/H2O2以caspase依赖和非依赖途径导致神经细胞凋亡。
　　4、鱼藤酮上调神经细胞NOX2及其调节蛋白表达及雷帕霉素抑制作用
　　实验以小鼠大脑皮层原代神经元为研究对象，用0-1μM鱼藤酮处理24 h、或用1μM鱼藤酮处理0-24 h、或用雷帕霉素预处理24 h后暴露0.5和1μM鱼藤酮24 h。采用Western Blotting检测NOX2及其调节蛋白p67phox，p47phox，p40phox，p22phox和Rac1以及caspase-3和PARP蛋白表达变化。结果显示,鱼藤酮以浓度和时间依赖方式诱导原代神经元NOX2、p67phox、p47phox、p40phox、p22phox和Rac1表达增加。重要的是，我们发现雷帕霉素明显抑制鱼藤酮诱导这些蛋白升高，且鱼藤酮诱导的Cleave-caspase-3和Cleaved-PARP的增加也被雷帕霉素有力地阻滞。提示:鱼藤酮上调神经细胞NOX2及其调节蛋白表达增加可能在ROS发生上有重要作用，雷帕霉素抑制NOX2及其调节蛋白可能具有削弱ROS产生而发挥抗鱼藤酮诱导神经细胞凋亡保护作用，更进一步的实验需要确认之。

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作者
周谦;
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作者单位

南京师范大学;

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授予单位南京师范大学;
学科生物学；生物化学与分子生物学
授予学位博士
导师姓名陈龙;
年度 2014
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 R329.28;
关键词
神经细胞; 细胞凋亡; 基因调控; 信号通路; 活性氧簇; 鱼藤酮;

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