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钙调蛋白和polo-like激酶1对哺乳动物细胞有丝分裂进入调控机理研究

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摘 要

前 言

第一章钙调蛋白和Polo-like激酶1对细胞周期调控研究进展(综述)

第二章钙调蛋白与Polo-like激酶1在细胞周期中时空特异性的结合

第三章钙调蛋白对Polo-like激酶1活性的调控作用

第四章钙调蛋白促进Polo-like激酶1对有丝分裂进入的调控

第五章Plk1和p53的相互作用调控UV引起的G2/M阻断恢复的作用机理

总结论

博士期间发表论文目录

附录：实验材料与仪器

致 谢

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摘要

细胞周期调控是一个多层次、多步骤的复杂过程。前期的研究表明，钙调蛋白(Calmodul in，CaM)对细胞顺利通过检验点的监视，完成细胞周期的正常运转具有重要调节作用，但是对其下游底物仍不清楚。Polo-like kinase 1(Plkl)是一种丝氨酸／苏氨酸激酶，它的作用贯穿整个有丝分裂的始终。我们通过生物信息学筛选发现Polo-Like激酶(Plkl)可能是一种CaM下游效应分子的候选蛋白质。分析显示Plkl具有三个潜在的CaM结合结构域，其中一个位于与定位密切相关的C端Polo盒内，两个位于N端的催化区。越来越多的证据表明，它的时空定位和顺序激活是发挥作用的关键，我们的结果显示，与Plkl发生时空特异性分布的钙调蛋白将激活Plkl并促使有丝分裂的进入。 1．CaM和Plk l在细胞分裂中期发生共定位。免疫荧光染色发现CaM和Plkl在细胞分裂中期主要共分布于纺锤体两极的微管组织中心处；免疫共沉淀及Western Blotting的结果亦显示在细胞有丝分裂中期，CaM和Plkl两者可以互相被对方所共沉淀。 2．CaM对Plk 1的活性起着调控作用。P1 kl的活性在细胞周期的G2／M转换期达到最高，用CaM的抑制剂处理同步化在此时的细胞可以抑制Plkl的活性。与对照细胞系相比，稳定表达CaM的细胞系具有较高的Plkl的活性。在HEK293细胞中过量表达突变型的CaM无法使Plkl的活性上升。 3．CaM通过提高Plkl的活性促进G2／M转换。Cdc25C是Plk1的一种直接底物，它在G2／M转换时发生高度磷酸化。在同步化到G2期的Hela细胞中，抑制CaM的活性可以抑制Cdc25C的磷酸化水平：和对照细胞系相比，稳定表达CaM的细胞系Cdc25C发生高度磷酸化。在HEK293细胞中过表达突变型的CaM，则不能使Plkl的底物Cdc25C发生高度磷酸化。 4．Plkl，Cdc25C和p53在G2／M期可以发生随接的瓦相作用并形成～一个复合物，Plkl通过使Cdc25C发生超磷酸化而激活其磷酸酶的活性，活化的Cdc25C使p53的Serl5发生去磷酸化并通过Mdm2介导的方式发生降解。 总之，CaM在有丝分裂中期与Plkl发生时空特异性分布，并且以一种CaMKII非依赖的方式调控它的激酶活性，它们的相互作用促进了有丝分裂的进入。

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