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【6h】

中药“脊髓康”对大鼠脊髓损伤后神经元的保护作用及机制研究

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目录

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摘要

中英文缩略词表

第一部分 理论研究

1 脊髓损伤的研究现状

1.1 西医药治疗现状

1.2 中医药与脊髓损伤

2 “脊髓康”的理论及研究基础

3 脊髓损伤与神经元凋亡相关分子

第二部分 实验研究

前言

实验一 大鼠脊髓神经元的体外分离、培养及鉴定

1 实验目的

2 实验动物

3 实验材料

4 实验方法

5 结果

实验二 神经元谷氨酸损伤模型的制备

1 实验目的

2 实验材料

3 实验方法

4 结果

实验三 “脊髓康”含药血清对脊髓损伤神经元凋亡的影响

1 实验目的

2 实验动物

3 实验材料

4 实验方法

5 结果

实验四 脊髓康含药血清影响脊髓神经元凋亡的机制初探

1 实验目的

2 实验材料

3 实验方法

4 结果

第三部分 讨论

1 体外培养脊髓神经元的影响因素

1.1 实验动物的选择

1.2 脊髓的分离及消化

1.3 脊髓神经元的纯化及鉴定

2 脊髓损伤神经元模型的建立及干预时间筛选

2.1 谷氨酸神经毒性与神经元损伤模型

2.2 造模后药物干预时间筛选

3 bcl-2、bax及Caspase 3与神经元凋亡的关系

3.1 bcl-2家族及bcl-2/bax比例与神经元凋亡

3.2 Caspase 3与神经元凋亡

4 脊髓康抗神经元凋亡分析

第四部分 全文总结与展望

1 主要研究结果

2 研究不足之处

3 有待继续探讨的问题

参考文献

攻读硕士学位期间取得的学术成果

致谢

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摘要

背景:脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是脊柱疾病和脊柱损伤的严重并发症,中医药所具备的多因素、多靶点作用的优点,正逐步成为促进SCI后神经再生的研究热点。中药复方“脊髓康”是基于SCI“肾督虚损,瘀阻督脉,枢机统率失职”病机特点,在“温肾通督”理论指导下组方而成的临床验方,大量前期研究已证实其促进SCI修复作用确切,然而其具体干预机制尚不明确。
  目的:体外构建大鼠脊髓神经元凋亡模型,观察“脊髓康”含药血清对损伤神经元的存活及凋亡的影响,探讨“脊髓康”抗脊髓损伤的可能作用机制。
  方法:体外分离培养鉴定大鼠脊髓神经元;制备谷氨酸诱导凋亡模型;以不同剂量中药复方“脊髓康”及强的松含药血清配制的完全培养基干预神经元损伤模型,通过形态学观察、CCK-8法、TUNEL法观察神经元的存活与凋亡,Western blot、qRT-PCR等分子生物学方法检测凋亡指标bcl-2、bax及Caspase3的表达。
  结果:(1)神经元存活情况:体外培养的脊髓神经元诱导凋亡后,大部分突触断裂回缩,部分胞核固缩、胞质出现空泡、胞体崩解;加入强的松及不同浓度的脊髓康含药血清培48h后,神经元坏死的速率呈现不同程度地减慢。其中强的松组细胞存活最多,轮廓清晰完整,再生突触交织成网,实验1组细胞坏死崩解较多,存活细胞轮廓模糊、再生突触稀疏,实验2、3组细胞存活较多,以实验3组细胞轮廓更清晰,折光强,存活细胞明显聚集生长。CCK-8结果显示,各组间细胞存活不全相同(P<0.01),除实验2组外,其余各组均高于模型组(P<0.01),三组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。
  (2)神经元的凋亡情况:神经元损伤后加入含药血清继续培养48h,模型组可见大量凋亡神经元,仅少量存活,形态不规则;强的松组存活神经元较多,少量细胞凋亡;脊髓康低剂量组大量神经元呈核质深染,胞体轮廓不清;中剂量组较多神经元凋亡,存活神经元排列紊乱,轮廓尚可见;高剂量组可见部分凋亡细胞,存活细胞突触明显,部分交织成网状。高剂量组凋亡率低于阳性对照组和中剂量组,与模型组比较有统计学意义(P<0.05);低剂量组与模型组比较无统计学差异(P>0.05)。
  (3) Western blot结果显示:各组神经元bcl-2、bax、Caspase3蛋白相对表达水平不全相同,表达高低依次为:bcl-2:高剂量组>强的松组>中剂量组>低剂量组>模型组(P<0.01);bax:模型组>低剂量组>中剂量组>高剂量组>强的松组(P<0.01)。bcl-2/bax比值:强的松组>高剂量组>中剂量组>低剂量组>模型组(P<0.01)。Caspase3:模型组>低剂量组>中剂量组>强的松组>高剂量组(P<0.001)。
  (4)荧光定量PCR结果与蛋白表达结果基本一致,各组mRNA表达高低依次为:bcl-2:强的松组>高剂量组>中剂量组>低剂量组(P<0.01);bax:低剂量组>中剂量组>高剂量组>强的松组(P<0.01)。bcl-2/bax:强的松组明显上调这一比例,脊髓康低、高剂量组高于中剂量组,但脊髓康低剂量组与高剂量组间比较无统计学差异(P=0.825>0.05)。Caspase3:强的松组和脊髓康高剂量组明显低于脊髓康低、中剂量组(P<0.01),而强的松组与脊髓康高剂量组间、脊髓康低、中剂量组间比较均无统计学(P>0.05)。
  结论:(1)100μM的Glu在一定程度上模拟了SCI后体内神经元生存的微坏境,能够引起体外培养的脊髓神经元的凋亡,可用于制备SCI的细胞模型。
  (2)强的松及脊髓康中、高剂量血清均有利于损伤后神经元存活,存活细胞数量三组间比较差异无统计学意义,降低凋亡率方面脊髓康高剂量组优于其他干预组。
  (3)强的松以及脊髓康3个剂量均能够提高神经元bcl-2蛋白及mRNA的表达、抑制bax、Caspase3蛋白及mRNA的表达,并上调bcl-2/bax的比值;脊髓康3个剂量中高剂量作用更明显,在上调bcl-2蛋白、抑制Caspase3蛋白表达略优于强的松组,其余指标均劣于强的松组但优于低中剂量组。结合神经元的存活率和凋亡率分析,推测脊髓康含药血清可能通过其他途径影响神经元的存活,或通过干预胶质细胞等间接影响神经元的凋亡或存活。

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