促红细胞生成素通过抑制GSK3β介导的Bax线粒体转位减少6-羟基多巴胺诱导的PC12细胞凋亡

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本文分为以下两个部分进行探讨：
　　第一部分 6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导PC12细胞凋亡及其可能机制
　　目的：采用6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)诱导PC12细胞损伤建立帕金森病的体外模型，探讨GSK3β在6-OHDA诱导的凋亡途径中的具体作用及6-OHDA对PC12凋亡的可能作用机制。
　　方法：采用6-羟基多巴胺诱导PC12细胞损伤建立帕金森病的体外模型，通过MTT检测以及台盼蓝染料排除试验检测不同浓度的6-OHDA处理后的PC12细胞活性和生存率。利用免疫印迹法测定:1、总GSK3β和p-GSK3β水平;2、Bax和β-肌动蛋白水平，β-肌动蛋白用作细胞质内蛋白的内参对照;3、Bax和prohibition蛋白水平，prohibition蛋白用作线粒体内蛋白的内参对照。
　　结果：1、6-OHDA刺激24后呈剂量依赖性(10、20、50、100、200μm)地抑制PC12细胞的细胞活性及细胞存活率。6-OHDA在100μM时显著抑制PC12的活性和存活率。
　　2、Western blot检测结果显示，6-OHDA处理呈时间依赖性地减少了GSK3β磷酸化。通过提取细胞线粒体和细胞质来检查Bax在细胞线粒体中存在的情况，结果显示6-OHDA处理后细胞质中Bax含量减少了，线粒体中Bax含量增加了，提示6-OHDA诱发了Bax的线粒体转位。
　　结论：6-OHDA显著降低了PC12细胞的活性，促进了PC12细胞凋亡，GSK3β在6-OHDA诱导的凋亡中起到一定作用，6-OHDA处理呈时间依赖性地减少GSK3β磷酸化，诱发了Bax的线粒体转位，Bax可从细胞溶质转位至线粒体中，引起线粒体功能障碍，进而导致细胞凋亡。
　　第二部分促红细胞生成素(EPO)对6-羟基多巴胺诱导PC12细胞凋亡的保护作用及其机制
　　目的：通过研究促红细胞生成素对6-OHDA处理的PC12细胞的糖原合成酶激酶3β的磷酸化、Bax的线粒体转位、Bcl-2表达水平、半胱天冬酶3活性，探讨促红细胞生成素(EPO)抑制6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的凋亡的机制。
　　方法：PC12细胞用TDZD-8(25μM)或用不同浓度的EPO(0-10U/mL)预处理，随后用100μM6-OHDA孵育。采用MTT检测和台盼蓝排除试验测定不同处理后的细胞活性;免疫印迹法观察GSK3β磷酸化水平、总GSK3β水平、Bax在细胞内分布情况、抗增殖蛋白水平、Bcl-2以及β-肌动蛋白水平;Hoechst33258染色法来估算凋亡PC12细胞的比例，使用半胱天冬酶3比色测定试剂盒系统估算半胱天冬酶3活性。
　　结果：1、EPO呈浓度依赖性地（浓度从1至10U/mL不等）降低6-OHDA诱导的生长抑制，GSK3β抑制剂4-苯基-2-甲基-1，2，4-噻二唑—3，5-二酮(TDZD8)显著逆转6-OHDA诱导的生长抑制。
　　2、EPO和TDZD-8显著逆转6-OHDA对GSK3β磷酸化的抑制，也显著抑制6-OHDA诱导的Bax线粒体转位。
　　3、6-OHDA不改变细胞质内的Bcl-2表达水平，而EPO和TDZD-8两者也不影响Bcl-2的细胞质内表达水平。但6-OHDA显著降低了Bcl-2的线粒体内表达水平，而加入EPO和TDZD-8后可逆转6-OHDA诱导的Bcl-2的线粒体内表达降低。
　　4、EPO和TDZD-8抑制6-OHDA诱导的细胞凋亡，6-OHDA显著增加半胱天冬酶3活性，而EPO和TDZD则显著抑制半胱天冬酶3活性升高。
　　结论：EPO通过促进6-OHDA处理的PC12细胞的GSK3β的磷酸化、从而减少Bax的线粒体转位、以及阻止线粒体内Bcl-2水平的降低、降低Caspase3活性，来抑制6-OHDA诱导的凋亡，进而发挥神经保护作用，提示EPO是一个很有潜力的神经保护药物。

著录项

作者
葛许华;
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作者单位

苏州大学;

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授予单位苏州大学;
学科神经病学
授予学位博士
导师姓名刘春风;
年度 2015
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类震颤麻痹综合征;神经系统药物;
关键词
帕金森病; 促红细胞生成素; 糖原合成酶激酶3β; Bax线粒体; 6-羟基多巴胺; PC12细胞; 药理作用;

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