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家蚕蜕皮激素受体和超气门蛋白在丝腺中的表达特征及其相关功能研究

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摘要

引言

第一章 文献综述

1 蜕皮激素

2 保幼激素

3 蜕皮激素受体EcR和超气门蛋白USP

3.1 EcR与USP的结构与功能

3.2 EcR和USP的研究进展

4 家蚕丝腺

5 实时定量PCR(Real-time qPCR)技术

5.1 基本原理

5.2 实时定量PCR的定量方法

5.3 实时定量PCR的仪器

5.4 实时定量PCR的应用与展望

6 等温量热滴定技术(ITC:Isothermal titration calorimetric)

6.1 ITC工作原理

6.2 ITC技术应用展望

第二章 材料和方法

2.1 家蚕品种及饲养

2.2 菌株、质粒

2.3 常用试剂和缓冲液

2.4 实验方法

第三章 20E诱导下家蚕丝腺EcR和USP基因的表达

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

第四章 体外培养家蚕丝腺中EcR和USP基因的表达

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

第五章 家蚕EcR-B1和USP结构域基因的克隆及原核表达

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论

第六章 ITC法研究BmEcR-B1D蛋白与蜕皮激素响应元件BmE75A-EcRE及其缺失突变体的相互作用

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.3 结果与分析

6.4 讨论

总结

参考文献

攻读学位期间发表的论文

致谢

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摘要

20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)是调节昆虫发育过程的重要激素。蜕皮激素受体(Ecdysone receptor,EcR)和超气门蛋白(Ultraspiracle,USP)组成的异源二聚体是昆虫20E的靶标。20E通过该异源二聚体诱导下游靶标基因的表达并传递20E信号。本文通过实时定量PCR技术检测了20E处理后体内和体外离体培养条件下EcR和USP基因在家蚕丝腺中的表达水平;分别克隆了家蚕蜕皮激素受体结构域EcR-B1D和超气门蛋白结构域USPD,并构建原核表达载体,通过转化大肠杆菌BL21,获得表达产物并进行了纯化;采用等温量热滴定技术(ITC技术)检测了蜕皮激素受体结构域蛋白EcR-B1D与蜕皮激素响应元件E75A-EcRE及其缺失突变体的结合反应。本研究主要内容包括:
  ⑴20E处理后BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因在家蚕丝腺组织中的表达。20E处理后BmEcR-A、BmEc R-B1和Bm USP基因在家蚕中、后部丝腺的表达相比对照组均有不同程度增加,表明20E能够促进更多BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因的表达。但中部丝腺和后部丝腺BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因的表达趋势并不相同。
  ⑵体外培养丝腺组织在20E处理后BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因的表达。离体培养丝腺组织经20E处理后BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因的表达相比于对照组均增加,并与体内实验的结果基本一致。在20E和JHⅢ共处理条件下,BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因的表达均上调,且强于20E单独处理组,这一现象在中部丝腺表现更为显著,表明JHⅢ在一定条件下能增强EcR和USP的表达。
  ⑶蜕皮激素受体结构域BmEcR-B1D和超气门蛋白结构域BmUSPD的原核表达。分别克隆得到家蚕蛋白结构域序列EcR-B1D和USPD。家蚕EcR-B1D长度为786bp,编码261个氨基酸残基,预测蛋白质分子量为29.66 kDa,等电点约为5.23;家蚕USPD长度为798bp,编码265个氨基酸,预测分子量为29.76kDa,等电点约为5.75。将BmEcR-B1D和BmUSPD克隆到表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经1 mmol/L IPTG诱导成功进行蛋白质表达并纯化。
  ⑷BmEcR-B1 D与BmE75A-EcRE及其缺失突变体的结合反应。在体外条件下通过等温滴定量热技术(ITC)获得了BmEcR-B1D蛋白与BmE75A-EcRE及其缺失突变体相互作用的一系列热力学参数包括亲和力常数(K)、反应热(△H)和熵(△S)。结果表明BmEcR-B1D蛋白能够与BmE75A-EcRE进行结合,并发现了BmE75A-EcRE的核心保守区为TCTTC。本实验通过分析20E诱导下体内和体外家蚕丝腺组织中BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因的表达,发现20E均可上调上述三种基因的表达水平;通过原核表达BmEcR-B1D和BmUSPD蛋白并利用ITC技术发现了BmE75A-EcRE的核心保守区。这些研究为进一步探究20E信号通路的作用机理、核受体的功能以及核受体与基因的相互作用关系作了一定的探索。

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