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成年大鼠创伤性脑损伤后的皮质与海马内源性神经发生研究

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第一部分 成年大鼠创伤性脑损伤后皮质的内源性神经发生

体内实验

材料与方法

结果

体外实验

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 奥拉西坦对成年大鼠创伤性脑损伤后海马内源性神经发生的影响

体内实验

材料与方法

结果

体外实验

材料与方法

结果

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摘要

本文从以下几部分进行了论述。
　　第一部分 成年大鼠创伤性脑损伤后皮质的内源性神经发生
　　目的:
　　探讨成年大鼠创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)后大脑皮质内源性的神经发生及其影响因素。
　　方法:
　　Ⅰ、体内实验
　　1.SD大鼠分为假手术(SHAM)组和TBI组,SHAM组大鼠只开颅,不制备脑损伤模型;TBI组大鼠采用颅脑液压损伤装置,制备创伤性脑损伤模型。
　　2.SD大鼠TBI后连续7d腹腔注射BrdU以标记新生的神经细胞。
　　3.TBI后1、3、7、14、28d应用免疫荧光法检测大鼠损伤区皮质nestin+/sox-2+神经前体细胞(neural progenitor cells, NPCs)、GFAP+/sox-2+放射状胶质样细胞、DCX+/BrdU+神经元前体细胞、MAP-2+/BrdU+新生神经元、NeuN+/BrdU+新生成熟神经元、GFAP+/BrdU+新生星形胶质细胞、CNP+/BrdU+新生少突胶质细胞的发生情况。
　　4.TBI后1、3、7、14、28d应用TUNEL/BrdU双标记技术检测大鼠损伤区皮质新生细胞的凋亡情况。
　　5.TBI后1、3、7、14、28d应用ELISA法检测大鼠损伤区皮质基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF-1)的表达水平。
　　6.TBI后1、3、7、14、28d应用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测大鼠脑脊液中谷氨酸含量。
　　Ⅱ、体外实验
　　1.分离培养大鼠TBI后损伤区皮质内源性NSCs(neural stem cells,NSCs)并进行鉴定,BrdU/Nestin免疫荧光检测其胚源性及增殖能力,MAP-2、GFAP、CNP免疫荧光检测其多向分化潜能。
　　2.传至第二代的NSCs行谷氨酸受体NMDA主要功能亚基NR1免疫荧光标记,流式细胞分析NR1阳性细胞百分比。
　　3.传至第二代的NSCs分空白对照组(Control)、谷氨酸组(Glu)、Glu+MK-801(0 h)组、Glu+MK-801(24h)组4组分化培养:Control组用DMEM/F12无血清培养基培养;Glu组在DMEM/F12无血清培养基中加入谷氨酸(5μM)培养;Glu+MK-801(0h)组在DMEM/F12无血清培养基中加入谷氨酸(5μM)培养同时加入NMDA受体拮抗剂MK-801(10μM);Glu+MK-801(24h)组在DMEM/F12无血清培养基中加入谷氨酸(5μM)培养24 h后加MK-801(10μM)继续培养;培养1、3、7、14d后行DCX、MAP-2免疫荧光检测NSCs向神经元分化情况,TUNEL法检测细胞凋亡情况。
　　4. Control组、Glu+MK-801(24h)组培养1、3、7、14d后,应用实时PCR检测NR1的mRNA表达情况,Western blot检测NR1的蛋白表达情况。
　　5.传至第二代的NSCs接种于Transwell培养体系的上室,分为空白对照(Control)组、TBI脑组织提取液(Extract)组、SDF-1组3组培养:Control组下室加入DMEM/F12无血清培养基;Extract组下室加入含有20μl/ml TBI脑损伤组织提取液的DMEM/F12无血清培养基;SDF-1组下室加入含有200ng/ml SDF-1的DMEM/F12无血清培养基。培养3d后行Hoechst33342染色检测细胞迁移情况,免疫荧光技术检测迁移细胞的趋化因子受体4(chemokine receptor4,CXCR4)表达情况。
　　结果:
　　Ⅰ、体内实验
　　1.免疫荧光技术检测损伤区皮质神经发生结果:TBI后1、3、7、14d损伤区周围皮质出现nestin+/sox-2+NPCs以及GFAP+/sox-2+放射状胶质样细胞,并在3d时达到高峰而后下降,在相应时间点GFAP+/sox-2+放射状胶质样细胞数量少于nestin+/sox-2+NPCs。伤后1、3、7d观察到nestin+/sox-2+NPCs从室周带后区(posterior periventricular area, PPv)沿胼胝体向损伤区迁移;伤后3、7、14d损伤区皮质观察到DCX+/BrdU+神经元前体细胞,7 d时达到高峰而后下降;仅在TBI后7、14d损伤区皮质观察到少量的MAP-2+/BrdU+新生神经元,在TBI后1、3、7、14、28d损伤区皮质均未观察到NeuN+/BrdU+新生成熟神经元;TBI后1、3、7、14、28d损伤区皮质均观察到GFAP+/BrdU+新生星形胶质细胞,7d时达到高峰并一直保持在较高水平;TBI后1、3、7、14、28d损伤区皮质均未观察到CNP+/BrdU+新生少突胶质细胞;在相应时间点,BrdU+细胞中星形胶质细胞多于NPCs和新生神经元。
　　2.TUNEL/BrdU双标记技术检测新生细胞的凋亡结果:TBI后1、3、7、14d损伤区周围皮质出现TUNEL+/BrdU+凋亡的新生细胞,TBI后7、14d时凋亡的新生细胞数量多于伤后1、3d,高峰在伤后7d,28 d时几乎未见凋亡的新生细胞。
　　3.ELISA法检测损伤区皮质SDF-1的表达水平结果:TBI后1d大鼠损伤区皮质SDF-1表达开始升高,3d时达到高峰,而后逐渐下降,14、28d时已接近SHAM组水平。
　　4. HPLC检测脑脊液谷氨酸含量水平结果:TBI组大鼠脑脊液内谷氨酸的含量伤后1d即达到高峰,而后逐渐下降,14d时已接近SHAM组水平。
　　Ⅱ、体外实验
　　1.成年大鼠TBI后损伤区皮质内源性NSCs鉴定结果:损伤区皮质内分离培养出NSCs球为BrdU+/Nestin+,并能扩增传代,可以分化为MAP-2+神经元、GFAP+星形胶质细胞以及CNP+少突胶质细胞。
　　2.流式细胞分析NSCs的NR1表达结果:成年大鼠TBI后损伤区皮质内源性NSCs中,43±1.06％细胞的谷氨酸受体NMDA主要功能亚基NR1阳性。
　　3.谷氨酸对NSCs向神经元分化影响结果:培养1d时Glu组、Glu+MK-801(24h)组的DCX+神经元前体细胞明显多于Control、Glu+MK-801(0h)组;3d时Glu+MK-801(24h)组DCX+神经元前体细胞最多,Glu组DCX+神经元前体细胞数量有所下降,但多于Control、Glu+MK-801(0 h)组;至7 d时Glu+MK-801(24 h)组DCX+神经元前体细胞仍较多,Glu组DCX+神经元前体细胞与Control、Glu+MK-801(0 h)组比较差异无统计学意义;14d时4组几乎未见DCX+神经元前体细胞,MAP-2免疫荧光检测显示Glu+MK-801(24h)组MAP-2+神经元明显多于其它3组;TUNEL法检测结果显示,体外培养1d后,4组可见少量凋亡细胞,3、7、14d时Control、Glu+MK-801(0h)、Glu+MK-801(24h)组凋亡细胞数量与1d时比较几乎无变化,而Glu组TUNEL+凋亡细胞数量3d时达到高峰,7d、14d时略有下降但多于其它3组。
　　4.实时PCR检测NR1的mRNA表达情况结果:Glu+MK-801(24h)组NR1的mRNA相对表达量呈逐渐升高趋势,7 d时达到高峰,除7、14d外,其它时间点两两比较差异有统计学意义;Control组NR1的mRNA相对表达量较低,各时间点差异无统计学意义;在相应时间点Glu+MK-801(24h)组NR1的mRNA相对表达量均高于Control组,差异均有统计学意义。
　　5.Western blot检测NR1的蛋白表达情况结果:Glu+MK-801(24h)组NR1的蛋白相对表达量呈逐渐升高趋势,7d时达到高峰,除7、14d外,其它时间点两两比较差异有统计学意义;Control组NR1的蛋白相对表达量较低,各时间点差异无统计学意义;在相应时间点Glu+MK-801(24 h)组NR1的蛋白相对表达量均高于Control组,差异均有统计学意义。
　　6.Transwell迁移实验检测脑损伤组织提取液及SDF-1对细胞迁移影响的结果:Extract组和SDF-1组迁移的细胞数量明显高于Control组,差异有统计学意义;Extract组和SDF-1组迁移的细胞数量差异无统计学意义;3组迁移的细胞大部分呈现CXCR4阳性。
　　结论:
　　成年SD大鼠TBI后,损伤区皮质内出现NPCs,其一部分来源于局部激活的放射状胶质样细胞,也有部分从PPv区沿胼胝体迁移而来,TBI后损伤区内高表达的SDF-1对其迁移起到了一定的作用;这些NPCs能够向神经元及星形胶质细胞分化,但前者未能最终发育为成熟的神经元,伤后损伤区内谷氨酸表达水平的增高既可以促进NPCs向神经元分化,但也可以促进分化过程中的神经元凋亡,后者与神经元在发育过程中NMDA受体表达的逐渐升高有关。
　　第二部分 奥拉西坦对成年大鼠创伤性脑损伤后海马内源性神经发生的影响
　　目的:
　　探讨奥拉西坦对成年大鼠TBI后海马内源性神经发生的影响及其机制。
　　方法:
　　Ⅰ、体内实验:
　　1.经水迷宫训练筛选出达标大鼠,分为空白对照组(Control)、生理盐水组(NS)、奥拉西坦组(Oxiracetam)3组:Control组只开颅,不制备脑损伤模型;NS组采用颅脑液压损伤装置制备TBI模型,TBI后连续14d定时每天一次尾静脉注射无菌生理盐水1ml;Oxiracetam组采用颅脑液压损伤装置制备TBI模型,TBI后连续14d定时每天一次尾静脉注射含有奥拉西坦(200mg/kg)的无菌生理盐水1ml。
　　2.TBI后第15d进行连续4d的定位巡航试验,第19d进行空间探索试验;
　　3.TBI后第20d应用DCX免疫荧光检测海马新生神经元情况,ChAT免疫荧光检测隔区及Meynert基底核胆碱能神经元情况。
　　4.TBI后第20d应用ATP检测试剂盒检测海马ATP含量。
　　5.TBI后第20d应用ELISA法检测海马乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)含量。
　　Ⅱ、体外实验:
　　1.从大鼠胚脑海马中分离培养NSCs并进行扩增,将传至第二代的NSCs接种于包被多聚赖氨酸盖玻片的24孔培养板内,分为空白对照组(Control)、生理盐水组(NS)、奥拉西坦组(Oxiracetam)3组: Control组加入DMEM/F12无血清培养基培养;NS组加入含有10μl/ml生理盐水的DMEM/F12无血清培养基培养;Oxiracetam组加入含有4mg/ml奥拉西坦的DMEM/F12无血清培养基培养,培养3d后行DCX免疫荧光检测NSCs向神经元分化情况,并收集细胞应用ATP检测试剂盒检测细胞内ATP含量。
　　2.取大鼠胚基底前脑原基制成单细胞悬液，在Transwell培养体系中分为空白对照组（Control）、胆碱能神经元组（Cholinergic neuron）、生理盐水+胆碱能神经元组（NS+Cholinergic neuron）、奥拉西坦+胆碱能神经元组（Oxiracetam+Cholinergicneuron）培养： Control组下室不接种鼠胚基底前脑原基制备的单细胞悬液，只加入DMEM/F12无血清培养基；Cholinergic neuron组下室接种鼠胚基底前脑原基制备的单细胞悬液并加入DMEM/F12无血清培养基培养；NS+Cholinergic neuron组下室接种鼠胚基底前脑原基制备的单细胞悬液并加入含10μl/ml生理盐水的DMEM/F12无血清培养基培养；Oxiracetam+Cholinergic neuron组下室接种鼠胚基底前脑原基制备的单细胞悬液并加入含有4mg/ml奥拉西坦的DMEM/F12无血清培养基培养；将从大鼠胚脑海马中分离扩增的NSCs接种于Transwell培养体系的上室，共培养3d后，行ChAT免疫荧光检测下室胆碱能神经元分化情况、DCX免疫荧光检测上室海马NSCs向神经元分化情况，收集各组培养液用ELISA法检测ACh含量。
　　3.取大鼠胚基底前脑原基制成单细胞悬液，接种于包被多聚赖氨酸盖玻片的24孔培养板内，分为空白对照组（Control）、生理盐水+TBI脑组织提取液组（NS+Extract）、奥拉西坦+TBI脑组织提取液组(Oxiracetam+Extract)，开始各组均用DMEM/F12无血清培养基培养。第4d换培养液时，Control组继续加入DMEM/F12无血清培养基；NS组加入含有20μl/ml脑损伤皮质提取液、10μl/ml生理盐水的DMEM/F12无血清培养基；Oxiracetam+Extract组加入含有20μl/ml脑损伤皮质提取液及4mg/ml奥拉西坦的DMEM/F12无血清培养基，再培养3d，然后行TUNEL法检测凋亡细胞。
　　结果：
　　Ⅰ、体内实验
　　1.定位巡航试验结果：Oxiracetam组和Control组大鼠逃避潜伏期少于NS组，差异有统计学意义。
　　2.空间探索试验结果：Oxiracetam组和Control组大鼠平台跨越次数高于NS组，差异有统计学意义。
　　3. DCX免疫荧光检测海马齿状回神经元前体细胞结果：Oxiracetam组损伤侧齿状回内DCX+神经元前体细胞最多，NS组次之，Control组仅见到少量的DCX+的神经元前体细胞，差异有统计学意义。
　　4. ChAT免疫荧光检测隔区及Meynert基底核胆碱能神经元结果： Control组可见到较多的ChAT+胆碱能神经元，Oxiracetam组损伤侧隔区及Meynert基底核ChAT+胆碱能神经元虽有减少但多于NS组，差异有统计学意义。
　　5.海马ACh含量检测结果：Oxiracetam组海马ACh含量低于Control组，但高于NS组，差异有统计学意义。
　　6.海马ATP含量检测结果：Oxiracetam组海马ATP含量低于Control组，但高于NS组，差异有统计学意义。
　　Ⅱ、体外实验
　　1. DCX免疫荧光标记检测奥拉西坦对海马NSCs向神经元分化结果：Control组、NS组、Oxiracetam组均可见少量DCX+神经元前体细胞，各组间DCX+神经元前体细胞数量差异无统计学意义。
　　2. ATP检测试剂盒检测细胞ATP含量结果：Oxiracetam组ATP含量高于Control组和NS组，差异有统计学意义。
　　3. ChAT免疫荧光检测胆碱能神经元原代培养结果： Cholinergic neuron组、NS+Cholinergic neuron组、Oxiracetam+Cholinergic neuron组均可见较多的ChAT+胆碱能神经元，3组间胆碱能神经元数量差异无统计学意义，Oxiracetam+Cholinergic neuron组ChAT免疫荧光强度较强；Control组未见ChAT+细胞。
　　4. DCX免疫荧光检测胆碱能神经元对海马NSCs向神经元分化结果：Oxiracetam+Cholinergic neuron组的DCX+神经元前体细胞最多，Cholinergic neuron组、NS+Cholinergic neuron组的DCX+神经元前体细胞多于Control组，除Cholinergicneuron组和NS+Cholinergic neuron组外，其余两两比较均有统计学意义。
　　5. ELISA法检测培养液中ACh含量检测结果： Cholinergic neuron组、NS+Cholinergic neuron组、Oxiracetam+Cholinergic neuron组培养中均能检测到ACh，Oxiracetam+Cholinergic neuron组培养液中ACh含量高于其它2组；Control组未检测到ACh。
　　6. TUNEL试剂盒检测奥拉西坦对胆碱能神经元免于凋亡的保护作用结果：NS+Extract组可见到较多的凋亡细胞，Control组和Oxiracetam+Extract组只见到少量凋亡细胞，3组间凋亡细胞数量两两比较差异均有统计学意义。
　　结论：奥拉西坦能够促进成年大鼠TBI后海马内源性的神经发生，明显改善TBI大鼠学习记忆认知功能障碍；奥拉西坦可以保护基底前脑胆碱能神经系统，促进胆碱能神经元ACh的分泌从而促进海马神经发生；此外，奥拉西坦还可以促进海马细胞ATP的产生，利于神经的发生。

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