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【6h】

STAT5b介导生长激素调控鸡IGF-I基因表达的研究

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第一部分 文献综述

1 GH/IGF轴及其调控机理

2 检测转录因子与DNA结合的主要实验技术

3 研究展望

4 本实验的目的及意义

第二部分 材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

第三部分 结果与分析

1 GH能够促进鸡肝细胞中IGF-I mRNA的表达

2 STAT5b结合位点的预测结果

3 体外细胞培养实验系统验证STAT5b结合位点的增强子作用

4 ChIP实验验证STAT5b结合位点的增强子作用

第四部分 讨论

1 鸡肝细胞的体外培养

2 GH促进IGF-I基因的表达

3 体外实验验证鸡IGF-I基因及其侧翼区序列上STAT5b结合位点的增强子作用

4 ChIP实验验证起增强子作用的STAT5b结合位点

5 实验中的一些注意事项

6 展望

第五部分 结 论

参考文献

附 录

攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文

致谢

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摘要

生长轴是动物体内从下丘脑-垂体-靶器官的一系列激素及其受体所组成的神经内分泌系统。生长激素(GH)通过IGF-I介导调节动物生长和细胞分化，通过提高生长轴中GH和IGF-I水平，促进增重、提高饲料转化率和改善肉品质，是畜禽生长调控的一种新途径。GH可以通过STAT5b的介导促进哺乳动物IGF-I基因的表达，本研究首先通过实时荧光定量PCR发现GH可以促进鸡原代肝细胞IGF-I基因表达的上调，然后通过生物信息学、分子克隆技术、体外细胞共转染实验、双荧光素酶报告基因检测实验和ChIP技术等研究了鸡IGF-I基因及其上下游侧翼序列上起增强子作用的STAT5b结合位点，试图弄清GH调控鸡的IGF-I基因表达的分子机理。主要研究结果如下：
　　(1)为了研究鸡肝脏中表达的IGF-I基因在离体条件下受GH调控的mRNA表达情况，以3～4周龄雌性商品代AA肉鸡为实验材料，采用改良的半原位两步灌流法并结合消化法分离肝细胞，进行原代培养；采用荧光定量PCR的方法，检测GH处理12 h后IGF-I mRNA表达情况。结果表明：胶原酶消化法所获得的肝细胞分离良好，形态完整，铺板4 h即贴壁，继续培养24 h即可用于GH处理实验；GH能够引起鸡肝细胞中IGF-I mRNA表达的上调。
　　(2)为了弄清楚GH促进鸡IGF-I mRNA表达上调是否通过STAT5b介导，首先利用生物信息学和VISTA程序对鸡IGF-I基因(NW_001471513)及其上下游侧翼端的STAT5b结合位点进行分析。结果发现：在鸡IGF-I基因约50 kb和其5'侧翼序列约40 kb以及其3'侧翼序列约10 kb共约100 kb序列上共含有57个STAT5b结合位点，按其顺序被命名为S1～n；TTCNNNGAA是人、小鼠、大鼠等物种保守的 STAT5b结合位点的共有序列；与小鼠等其他哺乳动物相比，并没有保守的STAT5b结合位点；与人类相应序列对比，在其保守区域共有两个STAT5b结合位点(S26和S31)，其保守性大于70%。
　　(3)为了研究IGF-I基因及其侧翼端序列上57个STAT5b结合位点中起增强子作用的位点，首先通过分子克隆技术将57个STAT5b结合位点分别克隆到荧光素酶报告基因载体上；然后通过体外细胞培养体系和双荧光素酶报告基因检测试验，找出能够介导 GH促进报告基因表达的位点；再通过位点突变实验和双荧光素酶报告基因检测试验分析IGF-I基因及其侧翼端序列上起增强子作用的STAT5b结合位点。结果发现：保守位点S26，在GH刺激下能够促进报告基因荧光素酶表达量极显著增加(p<0.01)；S26位点突变以后，荧光素酶表达量又显著性降低(p<0.05)，基本恢复本底水平；除保守位点S26外，还有S15，S19，S36和S53结合位点能够介导 GH促进报告基因荧光素酶表达量的增加；而且位点突变以后，荧光素酶表达量显著降低，基本恢复本底水平。
　　(4)为了进一步了解GH刺激机体细胞后，体内STAT5b蛋白与IGF-I基因上STAT5b结合位点的结合情况，通过ChIP技术和荧光定量PCR的方法检测GH处理12 h后体内STAT5b蛋白与IGF-I基因上STAT5b结合位点的结合情况。结果发现：不管是GH处理组还是PBS处理组，STAT5b抗体均可使S26位点得以显著富集(p<0.05)；而且GH处理组中S26相对富集量要比对照组高(p<0.05)，表明GH可以促进STAT5b和IGF-I基因上S26位点的结合；鸡IGF-I基因上保守的位点S26是STAT5b的结合位点；而该时间得到的沉淀DNA却没有检测到其他的STAT5b结合位点，这些位点可能在其他时间与STAT5b蛋白结合。

著录项

  • 作者

    王慧娟;

  • 作者单位

    苏州大学;

  • 授予单位 苏州大学;
  • 学科 遗传学
  • 授予学位 硕士
  • 导师姓名 顾志良;
  • 年度 2013
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类 Q575.11;Q344.13;
  • 关键词

    STAT5b因子; 生长激素; 基因IGF-I; 动物模型;

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