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大麻素受体CB2抑制剂AM630对钛颗粒诱导下巨噬细胞影响的实验研究

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[目的]研究大麻素受体CB2抑制剂AM630对钛颗粒诱导下巨噬细胞的影响，为临床治疗人工关节假体无菌性松动提供新的作用靶点。
　　 [方法]采用小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞，用四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）比色还原法观察AM630对RAW264.7细胞的生长抑制作用。酶联免疫法（ELISA）检测AM630作用于不同浓度的钛颗粒诱导下RAW264.7细胞分泌肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）细胞因子的量的变化。光镜下观察细胞形态学变化，caspase-3免疫组化法、流式细胞仪（FCM）分析诱导下RAW264.7细胞的凋亡等作用。TRAP染色观察AM630对RAW264.7细胞向破骨细胞转化能力的影响，免疫印迹法（Western blot）检测ERK蛋白水平变化。
　　 [结果]大麻素受体CB2选择性抑制剂 AM630在O-200nM浓度范围内不影响RAW264.7细胞增殖。小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞易贴壁，增殖速度快。加入钛颗粒后，光镜下可见RAW264.7细胞吞噬钛颗粒现象，并随着钛颗粒浓度增高，细胞增殖生长能力下降。培养上清液中 TNF-α细胞因子含量随钛颗粒浓度（0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml）增加而增加，与对照空白组相比p<0.05，具有统计学意义；而IL-1β细胞因子含量在钛颗粒浓度为0.5mg/ml、1mg/ml时与对照空白组有差别。加入AM630（100nM）后，细胞因子含量明显下降。caspase-3免疫组化染色后镜下可见钛颗粒组及AM630组均出现细胞胞浆呈黄色的caspase-3阳性细胞；并可见一些细胞皱缩，核边缘化、固缩或碎裂，甚至无核的胞浆深染的凋亡小体。在流式细胞DNA直方图上，钛颗粒组（0.1mg/ml）出现明显高耸的亚二倍体“凋亡峰”，细胞周期被阻滞在“S”期，其“S”期的比率为0.579±0.0105，明显高于对照组细胞的0.423±0.0079（t=23.74，p<0.01），而其G2/M期细胞明显减少。单纯AM630组亦出现细胞凋亡亚峰，其“S”期的比率为0.436±0.0116，和对照组细胞相似（t=1.88，p=0.1086>0.05）。在RANKL作用下RAW264.7细胞可向破骨细胞转化，可见许多细胞胞浆呈红色的TRAP染色阳性细胞，Western blot法检测ERK磷酸化水平显著增高；而加入AM630组TRAP染色阳性细胞数明显减少，ERK磷酸化水平降低。
　　 [结论]（1）钛颗粒能诱导巨噬细胞（RAW264.7细胞）分泌 TNF-α、IL-1β等细胞因子，与浓度呈一定的正相关；并引起细胞过度凋亡，抑制细胞增殖；在RANKL作用下巨噬细胞能向破骨细胞转化。（2）大麻素受体CB2选择性抑制剂AM630通过抑制CB2表达，降低钛颗粒诱导下巨噬细胞分泌 TNF-α、IL-1β细胞因子；促进细胞凋亡；并可能通过ERK通路抑制巨噬细胞向破骨细胞转化。因此大麻素受体CB2有望成为临床治疗磨损颗粒引起的假体无菌性松动的新靶点。

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