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鸡肉中弯曲菌的定量流行病学分析及其有机酸控制技术研究

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目录

摘要

符号说明

综述 零售鸡肉中弯曲菌的流行状况及控制技术研究进展

1 弯曲菌流行现状

1.1 弯曲菌的定性研究

1.2 弯曲菌的定量研究

2 鸡肉产品中弯曲菌的控制技术

2.1 肉鸡初级生产阶段

2.2 禽类屠宰加工阶段

2.3 食品消费阶段

展望

参考文献

第一章 扬州市区零售鸡肉中弯曲菌的定量流行病学研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 鸡肉中弯曲菌定性分析

2.2 鸡肉中弯曲菌定量分析

3 讨论

参考文献

第二章 可食用有机酸对零售鸡肉表面弯曲菌的抑制方法建立及应用

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 有机酸的筛选

2.2 酸浓度、时间和温度的单因素试验

2.3 响应面分析法优化浓度、时间和温度等控制条件

2.4 最优条件的验证

2.5 屠宰现场应用

3 讨论

参考文献

第三章 空肠弯曲菌flgS突变株的构建及其对细菌酸耐受的影响

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 空肠弯曲菌flgS突变株的构建

2.2 flgS失活对空肠弯曲菌酸耐受能力的影响

2.3 酸应激中flgS失活对其他胁迫相关基因的转录水平的影响

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢

声明

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摘要

弯曲菌是继沙门菌、志贺菌之后影响动物源性食品安全的又一个重要的人兽共患病原菌,不仅可导致人类胃肠炎和食物中毒,而且是人类格林-巴利综合征的重要前驱因子。该菌广泛存在于家禽肠道,尤其以鸡肠道定植最甚,并通过污染鸡肉导致人类感染。
  充分认知弯曲菌对动物源性食品安全的影响,并及时采取科学的控制措施,是防止该弯曲菌危害人类健康的关键途径。欧美等发达国家拥有相对完善的致病菌定量风险评估体系,包括弯曲菌对零售鸡肉的污染状况,大量研究数据可以增强对弯曲菌病爆发的预警能力。而发展中国家包括中国的定量风险评估数据则相对匮乏,这一现状严重制约了家禽生产及处理阶段的防控措施的发展。
  本研究对扬州市区零售鸡肉中的弯曲菌进行了为期一年的定量流行病学研究,并运用Box-Behnken Design的设计开展三因素三水平的响应面试验,优化有机酸对鸡肉表面弯曲菌的抑制条件,在此基础上构建了空肠弯曲菌的flgS突变株,比较突变株与野生株之间的酸耐受能力差异,为研究空肠弯曲菌的酸耐受机制及其调控因子提供试验数据,为建立鸡肉中弯曲菌的高效减菌技术提供理论基础。
  一、零售鸡肉中弯曲菌的定量流行病学研究
  2012年至2013年间,选取江苏省扬州市区3个超市和3个农贸市场,每月采集20份样品,使用平板计数结合分子生物学鉴定的方法,分别对其零售整鸡中的弯曲菌进行检测,并定量分析弯曲菌污染水平,连续监测12个月。
  检测结果表明,240份整鸡样品的弯曲菌阳性率为51.3%,阳性样品的平均带菌量为1473.49 CFU/g。123份阳性样品中,78.86%的样品带菌量超过20CFU/g。其中,超市样品的阳性率为35.8%,阳性样品的平均带菌量为152.3CFU/g;农贸市场样品的阳性率为66.7%,阳性样品的平均带菌量为2183.6CFU/g,农贸市场零售整鸡样品的弯曲菌污染情况明显更为严重。两种销售方式下,整鸡中弯曲菌污染水平随季节变化的趋势均很明显,随着夏季气温升高,样品的阳性率及阳性样品的平均带菌量均稳步上升,而冬季则大幅下降。空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的分离率最高,分别为45.5%和30.9%。定性及定量结果显示,扬州市区的零售整鸡中弯曲菌污染比较严重,控制零售环节中的整鸡弯曲菌带菌量迫在眉睫。
  二、有机酸对鸡肉表面弯曲菌的抑制方法建立及应用
  从《GB2760-2011食品安全国家标准食品添加剂使用标准》允许添加的有机酸中筛选出对弯曲菌抑菌性最强的乳酸。运用控制变量法,根据乳酸对空肠弯曲菌NCTC11168菌株的抑制率,对影响乳酸抑菌效果的3个单因素(浓度、时间、温度)分别进行实验,获得3个单因素的最佳抑菌区间。根据Box-Behnken Design的中心组合实验设计,以浓度、时间和温度3个因素为自变量,以抑菌率和肌苷酸含量作为响应值,采用响应面分析法在三因素三水平上对处理条件进行优化,以获得最大抑菌率和肌苷酸含量。建立了低浓度长时间处理模式及高浓度短时间处理模式,对最优条件进行验证,并将其应用于肉鸡屠宰加工生产线。
  结果表明,根据试验结果和回归方程,利用软件获得了低浓度长时间处理模式的最佳组合条件,即乳酸浓度0.19%,处理时间17min,处理温度20.9℃。在该条件下,抑菌率的预测值为98.62%,肌苷酸含量的预测值为1.8678mg/g。高浓度短时间处理模式的最佳组合条件为乳酸浓度0.82%,处理时间6.86s,处理温度7.97℃。在该条件下,抑菌率的预测值为98.81%,肌苷酸含量的预测值为1.8775mg/g。鸡肉模拟验证实验与理论预测值的误差在±1%以内,说明实验条件的参数准确可靠,按照建立的模型在实践中进行预测是可行的。将其应用于屠宰生产线上后,不会显著降低鸡肉中弯曲菌的阳性率,与传统次氯酸钠消毒的效果没有显著差异。单独使用本研究建立的两种抑菌模式对鸡肉进行处理,弯曲菌载量以及菌落总数之间没有显著差异,降低细菌载量的效果不及传统方法,但是二者结合的减菌效果则与对照组没有显著差异。
  三、空肠弯曲菌flgS突变株的构建及其在酸耐受中的作用分析
  根据GenBank上的空肠弯曲菌NCTC11168全基因组序列,以及质粒pRY107图谱设计引物,应用PCR技术扩增flgS基因以及卡那霉素抗性基因盒;将目的基因连接于克隆载体pMD-19T,转化感受态细胞,提取质粒,酶切鉴定;测序正确后,通过酶切连接反应将载体中的卡那霉素抗性基因盒插入flgS基因内部构建自杀载体pMD19T-flgS-kanr;将自杀载体电转化NCTC11168感受态细胞,同源重组筛选flgS突变株。
  分别对野生株和突变株的酸耐受能力进行了研究,在低浓度长时间酸胁迫和高浓度短时间酸胁迫中,突变株的抵抗力都明显低于野生株,而二者在中性生长环境中的生长情况无明显差异,表明flgS基因在空肠弯曲菌的酸耐受中扮演着非常重要的作用。鉴于flgS基因为调控基因,本研究应用荧光定量PCR方法对该基因在转录水平对其他胁迫相关基因的调控作用进行了研究。flgS基因失活后,在酸环境中,大部分胁迫相关基因都会出现上调,表明flgS基因失活会对其他胁迫基因转录表达造成影响。且flgS在不同酸应激中对其他胁迫基因的调控作用类似,只有rpoN(σ54因子)在两种应激中的表达量有很大差异,它在长期胁迫中代偿明显,在短期胁迫中的变化不明显。虽然存在胁迫基因代偿的现象,但是弯曲菌在酸性环境中的存活率还是大幅下降。因此我们推测弯曲菌的胁迫基因之间存在一个相互协调控制的复杂网络,flgS基因在感受和对抗酸应激方面起着不可替代的作用。

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