金属硫蛋白-3（MT-3）相互作用蛋白的分子克隆、鉴定及性质研究——探索金属硫蛋白-3及其相互作用蛋白功能的分子机制

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Alzheimer's病最显著的神经病理特征是神经突形成以淀粉样蛋白为核心的老年斑,由双股螺旋微丝构成的神经元纤维缠结以及大量的神经元丧失,尽管目前还无法确定AD的病因,许多证据已经表明,MT-3(又叫神经生长抑制因子,GIF)含量下降是造成AD脑大量神经元丧失的主要因素.MT-3主要分布于脑部中枢神经系统,在Alzheimer's症脑提取物的存在下,对培养的神经元细胞具有特异的生长抑制活性.值得注意的是,单独的MT-3或单独的脑提取物均不具有生长抑制活性,这表明,MT-3可能是与脑提取物中的其它因子协同作用而发挥其抑制功能的.迄今,对于MT-3对AD的作用机理,首次利用酵母双杂交系统(又称相互作用陷阱)在正常人脑cDNA文库中对GIF相互作用蛋白进行了快速筛选,并通过GST融合表达系统对筛选到的GIFIP基因进行了表达,再从蛋白质的水平上进一步分析,确证表达产物与MT-3的相互作用及细胞生物学协同活性.为了进一步证实dUTPase与MT-3相互作用的真实性和特异性,通过免疫共沉淀实验来验证它们在哺乳动物细胞293中的相互作用.将MT-3克隆于带Flag标签的真核表达载体pFlag-CMV-2,获得能表达Flag-MT-3的真核表达质粒MT-3/pFlag-CMV-2.将细胞核dUTPase cDNA克隆于带HA标签的真核表达载体pSV-HA中,获得表达HA-dUTPase融合蛋白的真核重组表达质料dUTPase/pSV-HA.使用Lipofectamine将MT-3/pFlag-CMV-2和dUTPase/pSV-HA共同转染293细胞,并以MT-1/pFlag-CMV-2和dUTPase/pSV-HA共同转染293细胞为对照,结果表明dUTPase可在哺乳动物细胞内与MT-1不发生相互作用,可与MT-3特异性结合.为了将来研究MT-3及其相互作用蛋白性质和功能的需要,鉴于蛋白单抗制备的困难,以大耳家兔为免疫动物,对MT-3及其相互作用蛋白的多抗进行了制备,进一步利用硫酸盐沉淀法分离纯化多抗IgG,通过一定的测定方法和相关研究实验初步证明,制备的多抗符合蛋白性质研究的一般需要.

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作者
陈巧林;
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作者单位

扬州大学;

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授予单位扬州大学;
学科临床兽医学
授予学位硕士
导师姓名史德浩,王宗元;
年度 2002
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总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 R749.160.2;
关键词
金属硫蛋白-3(MT-3); Alzheimer's症; 蛋白相互作用; 酵母双杂交系统; dUTPase; 基因表达; dUTP; 嗜铬细胞瘤株; 细胞死亡; Rab3a; 多抗IgG;

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