多肽/金属纳米簇的制备及其用于生物分析检测研究

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贵金属纳米簇以其具有光致发光、生物相容性等优点，已被广泛用于生物检测分析领域。然而，金属纳米簇的制备过程中大多需要外加还原剂，而还原剂的加入将影响模板的生物功能。并且在金属纳米簇的生物检测应用中，多数检测方法涉及偶联和标记的过程，步骤复杂不易操作。因此，发展一种无需还原剂且操作简单的金属纳米簇制备方法对其在生物检测方面的应用有重要意义。蛋白激酶作为生命体内重要的激酶，其活性和浓度与很多重大疾病和癌症紧密关联，因此建立高灵敏且操作简单的蛋白激酶检测方法，不仅可以提供癌症早期的筛查，还有助于其他磷酸化相关癌症的发现和抗癌新药的筛选。本论文致力于研究以多肽-金属纳米簇为荧光探针，设计一系列绿色、免标记、操作简单且灵敏的检测蛋白激酶新方法，为磷酸化相关疾病的早期诊断及抗癌药物的筛选提供帮助。主要研究内容如下：
　　1、以多肽-金纳米簇（peptide-Au NCs）为荧光探针，基于Zr4+能够诱导磷酸化的peptide-Au NCs发生团聚的原理，构建了一种无需标记、灵敏度高、操作简单的检测蛋白激酶CK2的方法。其中，以多肽为模板，通过多肽中的酪氨酸将Au3+还原成Au NCs，并且通过半胱氨酸捕获Au NCs，从而合成荧光peptide-AuNCs。这种在没有任何外加还原剂条件下制备peptide-Au NCs的方法既实现原位简单的制备多肽功能化的Au NCs，又使多肽免受还原剂的破坏，保持了多肽的生物活性，有益于peptide-Au NCs的进一步生物应用。在构建生物模板化的纳米材料时，利用一步制备peptide-Au NCs法，同时达到模板化的效果，避免了一般生物模板化的方法所必须的标记及偶联过程，以其为探针检测蛋白激酶CK2，其浓度与peptide-Au NCs荧光猝灭率成良好的线性关系，线性范围在0.08-2U/mL，检测限为0.027U/mL。通过对蛋白激酶CK2的抑制剂鞣花酸、DRB、大黄素和槲皮素在人体血清样品中的评估证明我们设计的这种peptide-Au NCs生物传感器可实现在复杂生物样品中对抑制剂的检测及筛选。正如预期，测得鞣花酸的IC50值（半抑制浓度）为0.045μmol/L。此生物传感同样可以检测更多的蛋白激酶，只需在相应蛋白激酶的底物多肽氨基端加入CCY多肽序列即可。我们设计的这种peptide-Au NCs构建的检测蛋白激酶的生物传感，由于其绿色、温和、通用、操作简单及免标记等优点，在蛋白激酶相关的生物化学基本研究及抑制剂的筛选领域提供了潜在应用。
　　2、利用多肽-银纳米簇（peptide-Ag NCs）较好的荧光性质，并以其为输出信号，实现对蛋白质磷酸化程度的检测（即蛋白激酶的活性）。在蛋白激酶CK2的催化下，多肽发生磷酸化作用。由于多肽的磷酸化作用能阻止羧肽酶Y对多肽的水解，因此在加入羧肽酶Y后，多肽不会发生水解。再利用一步多肽制备法，在不外加入任何还原剂的条件下制备了以多肽为模板及保护剂的peptide-Ag NCs。然而，在没有蛋白激酶CK2的情况下，羧肽酶Y将多肽水解成游离的氨基酸残基，不能制备peptide-Ag NCs。通过两者荧光强度的差异，实现对蛋白质磷酸化程度的免标记检测。此方法虽能实现对蛋白激酶的检测，但在制备peptide-Ag NCs过程中，外界因素（如温度控制、搅拌速率等）对制备的peptide-Ag NCs荧光强度有影响，从而可能影响到检测结果，并且与合成的peptide-Au NCs相比，peptide-Ag NCs的荧光发射强度较低，因此，还需进一步试验改进。
　　3、基于上述实验的不足，我们对蛋白激酶检测方法进行了改进。利用peptide-Au NCs为荧光探针，基于羧肽酶Y对peptide-Au NCs的猝灭作用，构建了一种新颖且灵敏的蛋白激酶PKA荧光“turn on”检测方法。其中，使用一种绿色的一步多肽生物矿化法成功制备了peptide-Au NCs。peptide-Au NCs被羧肽酶Y水解导致其荧光发生猝灭。然而，在蛋白激酶PKA的催化作用下peptide-Au NCs发生磷酸化，保护peptide-Au NCs的荧光不被猝灭。基于两者荧光强度的差别，实现对蛋白激酶PKA活性高灵敏的检测。通过对蛋白激酶PKA的抑制剂鞣花酸在人体血清样品中的评估，证明此检测蛋白激酶的方法可实现在复杂生物样品中对抑制剂的检测。据此，我们发展的蛋白激酶荧光“turn on”检测方法避免了多数蛋白激酶检测方法中涉及到的偶联和标记过程，避免“假阳性”信号的产生，提高了其抗干扰能力，以其操作简单及无需标记等特点，在实际生物领域中对磷酸化相关疾病的发现与早期诊断可能具有潜在应用。
　　4、利用peptide-Au NCs和CdSe/ZnS QDs@SiO2作为双发射的比率荧光探针（CdSe/ZnS QDs@SiO2@Au NCs），构建一种新颖、可视化且灵敏的比率荧光检测蛋白激酶PKA的方法。以多肽作为模板制备peptide-Au NCs的过程无需额外加入还原剂，避免多肽受到还原剂的破坏。此比率荧光探针对蛋白激酶PKA的检测范围在0.01U/mL-40U/mL，检测限为0.004U/mL。通过对人体血清中蛋白激酶PKA抑制剂的检测和筛选，证明此比率荧光探针在复杂生物样品中的潜在应用，测得IC50值为0.10μmol/L。我们构建的比率荧光检测蛋白激酶的方法，不仅可以消除光源或检测器的漂移以及环境条件等其他因素对检测结果的影响和干扰，还实现了紫外灯下的可视化检测。对今后磷酸化疾病的发现与早期诊断和对磷酸化相关疾病药物及抗癌药物的筛选与研发具有潜在应用。
　　5、以同一激发不同发射的两种生物矿化的金属纳米簇为双发射同时检测荧光探针，实现对蛋白激酶PKA和蛋白激酶CK2的同时检测。以蛋白激酶PKA和蛋白激酶CK2的底物多肽为模板分别制备发蓝光的peptide-Cu NCs和发红光的peptide-Au NCs。当加入一种蛋白激酶时，只有相应的多肽底物制备的金属纳米簇的荧光发生恢复，另一种金属纳米簇荧光强度保持不变，则可对蛋白激酶进行单独检测，并消除环境等因素对检测结果的影响，达到比率荧光检测的效果，对蛋白激酶的鉴别与筛选具有重要意义。当同时加入两种蛋白激酶时，两种金属纳米簇荧光同时增强，从而达到对两种蛋白激酶的同时检测。这种以两种金属纳米簇为荧光探针的方法，填补了金属纳米簇在同时检测领域应用研究的空白，以其操作简单、灵敏度高且可视化的特点，可以达到对两种蛋白激酶的分别检测及同时检测，从而对研究与具体蛋白激酶有关的疾病及癌症有潜在应用。

著录项

作者
宋玮;
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作者单位

南昌大学;

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授予单位南昌大学;
学科化学
授予学位博士
导师姓名邱建丁;
年度 2015
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类原子发射光谱分析法;生物化学检验、临床检验;
关键词
贵金属纳米簇; 多肽; 荧光探针; 磷酸化疾病; 蛋白激酶抑制剂; 癌症早期筛查; 生物检测分析;

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