HBV抗原诱导正常人淋巴细胞凋亡及胸腺肽α1对其凋亡抑制作用的研究

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目的：研究HBV抗原对正常人淋巴细胞凋亡的影响及胸腺肽a1抑制HBV抗原诱导淋巴细胞凋亡的作用，并探讨其意义。方法: (一)淋巴细胞的分离: 取健康人静脉血，肝素抗凝，用1640培养液对倍稀释，缓缓加到淋巴细胞分离液上层，离心，吸取淋巴细胞，洗涤后用1640培养液配成2×106/ml的细胞悬液。 (二)HBV阳性血清(HBV(+)S)诱导淋巴细胞凋亡的实验：将淋巴细胞悬液分为四组：①胎牛血清(FCS)对照组：0.9ml淋巴细胞悬液+0.1ml FCS；②正常人血清(NHS)对照组：0.9ml淋巴细胞悬液+0.1ml NHS；③HBV(+)S实验组：0.9ml淋巴细胞悬液+0.1ml HBV(+)S(不同HBV DNA含量：2.33×107 copy/ml、3.47×108 copy/ml、4.70×109 copy/ml)；④地塞米松(DEX)阳性对照组：0.9ml淋巴细胞悬液+0.1ml FCS+DEX(终浓度为1×10-5mol/L)，每组设6个平行孔。将各组细胞接种于12孔细胞培养板，置37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱孵育，于培养不同时间收集培养细胞，分别用瑞氏染色法及原位缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL)观察凋亡淋巴细胞形态，计算凋亡率；流式细胞仪(FCM)碘化丙啶(PI)染色法分析亚二倍体峰，计算凋亡率。同时设新鲜淋巴细胞对照组：取新分离淋巴细胞，不经培养，直接用上述方法检测淋巴细胞凋亡情况。 (三)胸腺肽叠a1(Ta1)对淋巴细胞凋亡影响的实验：实验分组与上述相同，再于各组分别加入不同剂量的Ta1(终浓度分别为：0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml与1O0μg/ml)，每组设6个平行孔，其它步骤同前，于培养72h收集培养细胞，采用流式细胞仪检测淋巴细胞凋亡率。结果： (一)凋亡淋巴细胞的特征：光学显微镜观察凋亡细胞形态主要特征为：用瑞氏染色法光镜下可见细胞核染色质浓缩，边聚及形成凋亡小体；TUNEL染色光镜下可见凋亡淋巴细胞核染棕褐色; 流式细胞术检出凋亡特征性亚二倍体峰。 (二)HBV抗原诱导淋巴细胞凋亡的实验结果： HBV(+)S实验组凋亡率明显高于NHS对照组及FCS对照组，差异具有显著性(P＜0.01)，提示HBV(+)S促进淋巴细胞凋亡作用强于NHS，其凋亡率随HBV DNA.含量的升高而增加，低剂量组(HBV DNA含量为2.33×107 copy/ml)、中剂量组(HBV DNA含量为3.47×108copy/ml)、高剂量组(HBV DNA含量为4.70×109 copy/ml)之间比较差异有显著意义(P＜0.01)。其凋亡率与HBV DNA含量呈正相关(r=0.813。P＜0.01)，并且细胞凋亡率的升高具有时间依赖性，未经培养的淋巴细胞几乎不出现凋亡，随着培养时间的延长凋亡率逐渐升高，培养24h、48h、72h组间比较，差异有显著性(P＜0.01)，淋巴细胞凋亡率与时间呈正相关(r=0.846，P＜0.01)。 (三)Tal抑制HBV诱导淋巴细胞凋亡实验结果：在FCS对照组、NHS对照组及HBV(+)S组分别加入中、高剂量Tal(50μg/ml、100μg/ml)时，与未加药组(0μg/ml)比较，均显示出明显抑制淋巴细胞凋亡的作用(P＜0.01)；但加入低剂量Tal(10μg/ml)时，仅有HBV(+)S组显示出明显抑制淋巴细胞凋亡的作用(P＜0.01)，而NHS及FCS对照组与相应未加药组(0μg/ml)比较，未出现明显抑制淋巴细胞凋亡的作用(P＞0.05)。Tal不同剂量组间比较差异有显著性意义(P＜0.01)，Tal对淋巴细胞凋亡抑制作用呈剂量依赖性，其药物浓度与淋巴细胞凋亡率呈负相关(r=-0.683，P＜0.01)。结论： ①本实验成功地建立了检测淋巴细胞凋亡的实验方法，包括瑞氏染色法、TUNEL染色法、流式细胞仪术(PI染色)。 ②首次采用多种检测细胞凋亡的方法较系统的观察了HBV抗原体外对正常人淋巴细胞凋亡的影响，从形态学、细胞凋亡峰等多项指标证实了HBV抗原在体外可诱导正常人淋巴细胞凋亡，并呈时间依赖性及剂量依赖性。 ③首次观察了Tal在体外对正常人淋巴细胞凋亡及HBV抗原诱导的淋巴细胞凋亡的影响，采用流式细胞仪检测技术证实了Ta1在体外具有明显抑制淋巴细胞凋亡的作用，并且对HBV抗原诱导的淋巴细胞凋亡作用更显著。

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作者
彭赛亮;
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作者单位

南昌大学;

南昌大学医学院;

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授予单位南昌大学;南昌大学医学院;
学科免疫学
授予学位硕士
导师姓名徐燕萍;
年度 2007
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 R392.11-33;
关键词
HBV抗原; 淋巴细胞凋亡; 胸腺肽a1; 抑制作用; 流式细胞仪;

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