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【6h】

天山雪莲细胞培养物体外抗骨质疏松作用研究

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摘要

引言

1 文献综述

1.1 骨质疏松症的研究进展

1.1.1 骨质疏松症的发病机理、危害和治疗

1.1.2 破骨细胞

1.1.3 成骨细胞

1.1.4 成骨细胞分化的信号调节通路

1.2 天山雪莲细胞培养物

1.2.1 制备方法

1.2.2 活性成分

1.2.3 功效研究进展

1.3 本文的选题依据和研究内容

2 天山雪莲细胞培养物对RANKL诱导形成破骨细胞的影响

2.1 实验材料与设备

2.1.1 实验试剂

2.1.2 天山雪莲细胞培养物

2.1.3 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 RAW264.7诱导成为破骨细胞

2.2.2 天山雪莲细胞培养物对RAW264.7细胞的作用

2.2.3 TRAP活性检测

2.2.4 乳酸脱氢酶活性检测

2.2.5 细胞凋亡检测

2.2.6 RT-PCR检测TRAP和MMP-9表达

2.2.7 实验数据处理及统计分析

2.3 实验结果

2.3.1 RAW264.7诱导成为破骨细胞

2.3.2 天山雪莲细胞培养物对破骨细胞形成的影响

2.3.3 天山雪莲细胞培养物对破骨细胞的影响

2.4 讨论

2.5 小结

3 天山雪莲细胞培养物对MG-63细胞增殖和分化的影响

3.1 实验试剂和仪器

3.1.1 细胞株

3.1.2 实验试剂

3.1.3 天山雪莲细胞培养物

3.1.4 实验仪器

3.2 实验方法

3.2.1 细胞培养

3.2.2 细胞增殖MTT

3.2.3 乳酸脱氢酶活性

3.2.4 碱性磷酸酶活性

3.2.5 Ⅰ型胶原蛋白含量

3.2.6 矿化骨结节形成

3.2.7 RNA提取及RT-PCR

3.2.8 Western blot检测OPG和RANKL蛋白表达

3.2.9 SB203580处理实验

3.2.10 实验数据处理及统计分析

3.3 实验结果

3.3.1 细胞增殖MTT和乳酸脱氢酶活性

3.3.2 碱性磷酸酶活性

3.3.3 Ⅰ型胶原蛋白含量

3.3.4 矿化骨结节形成

3.3.5 RT-PCR检测OPG和RANKL表达

3.3.6 Western blot检测OPG/RANKL

3.3.7 MG-63细胞的p38 MAPK信号通路调控作用

3.4 讨论

3.5 小结

结论

展望

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢

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摘要

骨质疏松症现已成为全球性的公共健康问题。成骨细胞介导骨形成和破骨细胞介导骨吸收,二者动态平衡被破坏是引发骨质疏松的内在原因。天山雪莲(Saussureainvolucrata Kar.et Kir,S.involucrata)是我国稀有的传统名贵药材,具有补肾活血,强筋骨,温肾助阳等功效。雪莲培养物是采用现代生物技术而获得的愈伤组织团块或细胞,其药理及功效研究是当今天山雪莲研究及开发的热点。本论文研究是以人成骨细胞MG-63为对象,探究天山雪莲细胞培养物对成骨细胞增殖、发育的影响及作用机制,以小鼠巨噬细胞RAW264.7作为破骨前体细胞,探讨其对破骨细胞形成的影响以及对成熟破骨细胞的作用。
  RAW264.7细胞在核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)诱导下分化为破骨细胞。雪莲培养物的加入可抑制破骨细胞的形成,并且剂量依赖性地降低抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性。对已形成的破骨细胞,乳酸脱氢酶(LDH)活性检测和Annexin V-PI双染流式细胞术结果一致,雪莲培养物可破坏破骨细胞细胞膜,增加胞外LDH酶活,诱导破骨细胞凋亡。RT-PCR结果进一步说明,天山雪莲细胞培养物通过下调TRAP和基质金属蛋白酶(MMP-9) mRNA表达抑制破骨细胞骨吸收功能。
  以MG-63细胞为研究对象,MTT结果表明,黄酮浓度为31.25μg/mL和62.5μg/mL的天山雪莲细胞培养物对成骨细胞无细胞毒性,125μg/mL浓度下有细胞毒性。天山雪莲细胞培养物可显著提高碱性磷酸酶(ALP)活性从而促进其早期分化;天山雪莲细胞培养物还可提高胶原蛋白中的4.羟脯氨酸含量,并促进矿化结节形成,从而促进成骨细胞矿化;同时,并上调OPG/RANKL表达比值,从而影响骨形成活性。以p38特异性抑制剂SB203580干预成骨细胞,结果表明SB203580显著抑制天山雪莲细胞培养物对成骨细胞增殖、ALP活性、矿化结节形成的促进作用以及对胶原蛋白积累量的提高作用;并抑制天山雪莲细胞培养物对成骨细胞OPG/RANKL表达的上调,说明天山雪莲细胞培养物可通过调控p38 MAPK信号通路来促进成骨细胞骨形成活性。
  综上,天山雪莲细胞培养物对破骨细胞形成具有抑制作用,并能破坏已形成的破骨细胞,降低骨吸收活性;同时,能够促进成骨细胞增殖、分化和矿化,表明天山雪莲在细胞水平上具有潜在的抗骨质疏松功效。

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