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万古霉素敏感性下降金黄色葡萄球菌的耐药机制研究及万古霉素联合治疗方案探索

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摘要

英文缩略词

第一部分：抗生素联合暴露可选择性改变金黄色葡萄球菌对万古霉素中介耐药的发展

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第二部分：附加抗菌药物决定万古霉素中介耐药金黄色葡萄菌发展的基因通路的异质性

1 前言

2．1 材料

2．2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第三部分：万古霉素联合β-内酰胺类抗菌药物对Mu3，异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性研究

1 前言

2．1 材料

2．2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

本论文创新性自我评价

参考文献

综述 万古霉素敏感性下降金黄色葡萄球菌的临床意义

攻读学位期间取得的科研成果

致谢

个人简历

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摘要

目的:
　　万古霉素敏感性下降金黄色葡萄球菌包括万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌(Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus，VISA)、异质性万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌(Heterogeneous Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus，hVISA)以及耐受性菌株。这些菌株往往与万古霉素(Vancomycin，VAN)治疗效果不佳有关，同时对二次治疗更加耐药。VAN治疗失败的问题备受临床关注，积极探索防止这类菌株出现及传播的策略、明确其分子生物学耐药机制以及寻找有效的治疗方案十分必要。
　　方法:
　　选取Mu3(VAN MIC=2mg/L)作为研究菌株，将其暴露在不同的抗菌药物环境中，进行为期28天的体外诱导耐药。抗菌药物暴露方案为VAN单药，VAN联合头孢唑啉(Cefazolin，CFZ)、磷霉素(Fosfomycin，FOF)、庆大霉素(Gentamicin，GEN)、美罗培南(Meropenem，MEM)、利福平(Rifampin，RIF)、哌拉西林他唑巴坦(Piperacillin-Tazobactam，TZP)以及磺胺甲恶唑/甲氧苄啶(Trimethoprim-Sulfamethoxazole，SXT)。对Mu3和经体外诱导出的菌株进行抗菌药物敏感性测定，并检测细胞壁厚度、类胡萝卜素含量及膜流动性。然后对Mu3及所有诱导出的菌株进行全基因组测序。基因组DNA的提取由JANUS自动化工作站完成。DNA文库的制备应用NextEra XTDNA提取试剂盒制备。全基因组测序在NexSeg仪器进行，测长2*150bp。最后通过体外药代动力学/药效动力学(Pharmacokinetic/Pharmacodynamics，PK/PD)模型实验，通过高精度色谱泵模拟不同药物的半衰期，运行48小时，评价VAN联合待测3种β-内酰胺类抗菌药物对hVISA菌株——Mu3的体外抗菌活性，并设定β-内酰胺类抗菌药物的给药频次为每24小时一次，每12小时一次和每8小时一次，以观察不同的给药频次在与VAN联合应用时的杀菌作用。分别在第0、1、2、4、6、8、12、24、26、28、32和48h从模型中采样进行菌落计数，绘制时间杀菌曲线，通过计算时间杀菌曲线下面积(Area Under the Curve，AUC)来比较抗菌药物的杀菌作用。
　　结果:
　　经过28天的体外抗菌药物暴露，VAN联合β-内酰胺类抗菌药物仅使VAN MIC上升至2-4mg/L，其中VAN+CFZ和VAN+TZP联合用药组最为有效，VAN MIC仅为2mg/L。Mu3暴露于其他抗菌药物组合，除了VAN+FOF，在第7天时均能阻止VAN MIC的上升，但是从第二周开始就不再表现出抑制VAN MIC上升的作用，使VAN MIC上升至4-16mg/L。细胞壁厚度与VAN MIC呈正相关(R2=0.939)。对比经VAN单药诱导出的菌株，经VAN+β-内酰胺类抗菌药物诱导出的菌株的细胞壁厚度明显减小，而经VAN联合非β-内酰胺类抗菌药物诱导出的菌株细胞壁厚度明显增厚。类胡萝卜素含量(R2=0.267)和膜流动性(R2=0.680)与VAN MIC之间无相关性。
　　对全部25株菌株进行全基因组测序共检测到60个独立的变异位点，包括51个单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，3个基因插入和6个基因缺失。经VAN+CFZ诱导耐药的菌株与母代菌株Mu3比对无任何基因突变发生。只有经VAN+RIF诱导耐药的菌株发生了rpoB突变(3/24)，为A471G和H481N。pbp2突变全部表现在经VAN+MEM诱导出的菌株中(3/24)(S499Y，P505T，G631R，G631V)，而mecA突变G487D，G574D均由VAN+TZP诱导出(3/24)。rpoC突变(7/24)在经VAN单药(3/3，L1150H)、VAN+SXT联合暴露(3/3，L1150H，D1160V和R967G)和VAN+MEM联合暴露(1/3，V669L)诱导的菌株中均有发现，表现为多态性。walR突变仅由VAN+FOF(1/24)诱导产生的;walK突变发生在经VAN+GEN(2/3)、VAN+SXT(1/3)和VAN+RIF(1/3)诱导的菌株中，也表现出多态性(S584I，A243T，I183K，V383I)。4/24的菌株检测出vraG突变，分别为分布在经VAN+GEN(1/3)、VAN+SXT(2/3)和VAN+FOF(1/3)诱导的菌株中，也表现为多态性。仅有2/24菌株被诱导出mprF突变(S295L，S337T)，分别由VAN+RIF和VAN+FOF诱导出。
　　在体外PK/PD模型实验中，VAN单药组在24小时时表现出了对Mu3的杀菌活性，但是从32小时到48小时出现了细菌再生长，所有的待测β-内酰胺类抗菌药物对Mu3均未显示出杀菌活性。在联合用药模型中，除了VAN+CFZ组在12小时时显示了对Mu3的杀菌活性，VAN+MEM组和VAN+TZP组均在8小时时表现出了对Mu3的杀菌活性。对比VAN单药组，在所有的VAN+β-内酰胺类抗菌药物的联合用药方案中，无论何种β-内酰胺类抗菌药物，无论β-内酰胺类抗菌药物的给药频次如何均未见细菌再生长。对比VAN单药组，VAN+β-内酰胺类抗菌药物联合用药方案在达到杀菌活性的时间(P＜0.005)和AUC(P＜0.001)两方面均表现出更强的杀菌活性，具有显著差异。在所有联合用药方案中，VAN+MEM组和VAN+TZP组的AUC明显小于VAN+CFZ组(P＜0.01)。在所有的VAN联合β-内酰胺类抗菌药物的方案中，变换β-内酰胺类抗菌药物的给药频次，对Mu3的杀菌活性无论是在达到杀菌作用的时间还是AUC均没有明显差异。
　　结论:
　　该研究清楚地表明，在体外VAN联合治疗能显著地影响hVISA向VISA转变。但只有VAN联合β-内酰胺类抗菌药物有效的抑制了VAN耐药的发展。鉴于VAN联合β-内酰胺类抗菌药物具有抑制VAN耐药的作用，该联合用药方案作为治疗严重MRSA感染的长期治疗方案还应做进一步的探讨。VAN单药及VAN+GEN、VAN+SXT、VAN+RIF和VAN+FOF在体外诱导出的菌株虽都为VISA表型，但决定其表型的基因通路却各有差异。VAN+CFZ联合用药抑制了VISA表型发展的基因通路，阻止了hVISA向VISA转变。在体外PK/PD模型中，VAN联合β-内酰胺类抗菌药物显示出了协同作用。在与VAN联合用药时，同种β-内酰胺类抗菌药物不同的给药频次之间对Mu3的杀菌作用无明显差异。故在VAN与β-内酰胺类抗菌药物联合用药方案中推荐β-内酰胺类抗菌药物每日一次给药。

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