袖状胃切除术影响脂肪组织caveolin-1表达在改善胰岛素抵抗与内质网应激中的作用研究

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目的:
　　本研究拟进一步应用3T3-L1前脂肪细胞分化成3T3-L1脂肪细胞，然后诱导成胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞，通过检测并比较胰岛素抵抗后的3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取率及caveolin-1、IR、GLUT4以及ERS相关蛋白表达的改变，初步在细胞水平考察胰岛素抵抗时caveolin-1与ERS的关系;进一步在胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞中转染过表达caveolin-1的慢病毒质粒(LV-Cav1)及caveolin-1沉默的慢病毒质粒(LV-Cav1-RNAi)，并葡萄糖摄取率及caveolin-1、IR、GLUT4以及ERS相关蛋白表达的改变，探讨分析干预caveolin-1表达影响ERS改变对脂肪细胞胰岛素抵抗的作用。本研究将为探索脂肪细胞胰岛素抵抗的新机制，以及寻找改善胰岛素抵抗的新手段提供重要的依据。
　　实验方法:
　　1、db/db小鼠30只机分配至3组:db/db组（10只），袖状胃切除术组db/db-SG组（10只），假手术组db/db-sham组（10只）;10只同窝野生型小鼠(db/m)作为阴性对照组db/m组（10只）参与实验。
　　2、3T3-L1前脂肪细胞经诱导分化、建立胰岛素抵抗模型成功后入选实验，流式细胞术观察胰岛素抵抗状态下脂肪细胞葡萄糖摄取，进一步探讨caveolin-1改善脂肪细胞胰岛素抵抗作用的机制。
　　实验结果:
　　一、手术结果
　　SG组大鼠术后死亡1只，死因为吻合口出血（术后第1天），db/db-sham组术后7天死于切口感染1只，其他组无死亡。
　　二、术后小鼠体重变化
　　术前db/db-SG、db/db-sham及db/db组小鼠体重明显高于db/m组，但db/db3个组别相比，组间体重无显著性差异(P＞0.05)。术后1周起，db/db-SG、db/db-sham组小鼠体重均有不同程度降低，术后3周时体重有所增加，并维持在该水平。db/db-SG组降低明显与其他两组有统计学意义(P＜0.01)。
　　三、术后摄食量的变化
　　术前db/db各组间摄食量无显著性差异。术后SG组摄食量明显下降，21天时有略上升趋势，但仍低于其他两组，差异有统计学意义（P均＜0.01）。
　　四、术前、术后空腹血糖(FBS)的变化
　　术前db/db-SG组、db/db-sham组、db/db组FBS水平明显高于db/m组，差异具有显著性（P均＜0.01）。术后30天时SG组FBS值已基本降至正常范围，并与db/m组无显著性差异。
　　五、术后口服葡萄糖耐量的变化
　　术前db/db-SG组、db/db-sham组、db/db组OGTT曲线下面积(area under curve，AUC)值显著大于db/m对照组（P均＜0.05）。术后30天时，SG组AUC值显著降低，与db/m组无差异显著性，db/db-SG组AUC值显著低于db/db-sham和db/db组对照组(P＜0.01)。
　　六、术后血清胰岛素的变化
　　术前db/db-SG组、db/db-sham组、db/db组小鼠基础餐前胰岛素水平无差异，且均高于db/m对照组(P＜0.05)，餐后胰岛素水平进一步升高，亦明显高于对照组。术后SG组血清空腹胰岛素及餐后胰岛素水平下降，低于db/db-sham及db/db组(P＜0.05)，与db/m组相比无明显差异（P＞0.05）。
　　七、手术对db/db小鼠胰岛素抵抗的影响
　　术前术前db/db-SG组、db/db-sham组、db/db组小鼠HOMA-IR值均显著高于db/m组，表明术前db/db小鼠存在明显的胰岛素抵抗，差异有统计学意义(P均＜0.05)。术后SG组HOMA-IR值明显降低，并与db/m组HOMA-IR值无明显差异(P＞0.05)，而该两组HOMA-IR值明显低于db/db组及db/db-sham组，有显著性差异（P＜0.01）。
　　八、手术对血清TC、TG、LDL的影响
　　术前db/db-SG组、db/db-sham组及db/db组TC、TG、LDL值显著高于对照组（P均＜0.01）。术后30天时，SG组TC、TG、LDL值明显下降，低于db/db-sham组及db/db组(P均＜0.01)。
　　九、手术对血清脂联素的影响
　　术前db/db-SG组、db/db-sham组及db/db组脂联素水平显著低于db/m对照组。术后30天时，db/db-SG组脂联素明显升高，与db/db-sham组及db/db组相比有统计学意义（P＜0.01）。
　　十、免疫组织化学法检测脂肪组织caveolin-1及GLUT4表达
　　通过免疫组化检测各组小鼠附睾脂肪组织caveolin-1及GLUT4的表达情况，结果发现:与db/m小鼠比，db/db小鼠的caveolin-1及GLUT4的表达减弱;而与db/db小鼠比，db/db-SG组小鼠的caveolin-1及GLUT4的表达增强，而db/db-sham组无明显改变。
　　十一、SG手术对小鼠脂肪组织caveolin-1、GLUT4、endocanmRNA表达的影响
　　Real-time quantitative PCR检测小鼠附睾脂肪组织caveolin-1及GLUT4 mRNA相对表达量，结果显示db/db-SG组小鼠脂肪组织caveolin-1及GLUT4mRNA表达较db/db组和db/db-sham组均明显上升(p＜0.05).
　　十二、SG手术对小鼠脂肪组织caveolin-1、GLUT4、endocan及GRP78、IRE-1、XBP-1蛋白表达的影响
　　Western blot检测小鼠附睾脂肪组织caveolin-1、GLUT4、endocan(ESM-1)以及ERS标志物GRP78，IRE-1及XBP-1蛋白相对表达量，提示术后脂肪细胞内质网应激程度明显缓解至接近正常(p＜0.01)。
　　十三、3T3-L1前脂肪细胞诱导分化及胰岛素抵抗
　　诱导胰岛素抵抗后，脂肪细胞摄取荧光葡萄糖量明显减少。
　　十四、3T3-L1胰岛素抵抗细胞GLUT4、caveolin-1、ERS相关蛋白表达的变化
　　通过qRT-PCR检测3T3-L细胞诱导前后GLUT4、caveolin-1的mRNA表达变化，表明诱导3T3-L1细胞胰岛素抵抗后，细胞的ERS反应明显增高。
　　十五、caveolin-1干预的胰岛素抵抗的脂肪细胞的构建与验证
　　证实了Cav1-shRNA慢病毒质粒转染可明显的下调caveolin-1的表达，即caveolin-1沉默的细胞模型构建成功。
　　十六、caveolin-1沉默的脂肪细胞葡萄糖摄取能力的改变
　　通过细胞摄取2-NBDG后，说明caveolin-1沉默明显的降低了3T3-L1细胞对胰岛素刺激下的葡萄糖摄取能力。
　　十七、caveolin-1过表达的脂肪细胞模型构建与验证
　　caveolin-1过表达的细胞模型构建成功。
　　十八、caveolin-1过表达的脂肪细胞葡萄糖摄取能力的改变
　　通过细胞摄取2-NBDG后，流式检测caveolin-1过表达后细胞内平均荧光强度的变化，与NC转染组比，Cav-1 cDNA转染组细胞平均荧光强度明显增高，说明caveolin-1过表达明显的升高了3T3-L1胰岛素抵抗细胞对胰岛素刺激下的葡萄糖摄取能力。
　　十九、干预caveolin-1表达对胰岛素抵抗脂肪细胞GLU4表达及ERS功能的影响
　　在3T3-L1胰岛素抵抗脂肪细胞中转染caveolin-1沉默的慢病毒质粒(LV-Cav1-RNAi)72h后，通过qRT-PCR和WB检测了GLUT4的mRNA及蛋白表达水平，结果表明caveolin-1可负性调节ERS蛋白的表达。
　　结论:
　　1、SG术后短期内db/db小鼠体重及摄食量明显减低，血清TC，TG，LDL趋于正常，脂联素水平上升，胰岛素抵抗减轻。
　　2、SG术能够上调db/db小鼠脂肪组织caveolin-1、GLUT4及endocan(ESM-1)mRNA和蛋白的表达，减轻炎症反应，增强组织对葡萄糖的摄取转运。
　　3、SG手术能够抑制db/db小鼠脂肪组织内质网应激通路蛋白GRP78，IRE-1及XBP-1蛋白表达，使内质网折叠蛋白质能力增强，缓解内质网高负荷，减轻内质网应激水平，从而增加脂肪组织对胰岛素的敏感性，改善脂肪组织的胰岛素抵抗。
　　4、3T3-L1前脂肪细胞可定向分化为成熟脂肪细胞，地塞米松可成功诱导脂肪细胞胰岛素抵抗。
　　5、诱导3T3-L1分化成熟及胰岛素抵抗后，脂肪细胞葡萄糖摄取减少，caveolin-1和GLUT4 mRNA和磷酸化蛋白表达下降，内质网应激通路蛋白GRP78、p-IRE1、XBP1及p-PERK的表达均明显升高，提示胰岛素抵抗状态下脂肪细胞内质网负荷加重，未折叠蛋白反应激活，内质网应激增强。
　　6、caveolin-1可影响脂肪细胞的葡萄糖代谢及GLUT4表达，同时负性调节ERS蛋白的表达，这可能是导致细胞对胰岛素反应性下调，在胰岛素刺激下葡萄糖摄取能力降低，导致胰岛素抵抗的原因之一。

著录项

作者
赵文嫣;
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作者单位

中国医科大学;

展开▼
授予单位中国医科大学;
学科外科学；普通外科学
授予学位博士
导师姓名刘金钢;
年度 2015
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类其他外科学;
关键词
2型糖尿病; 袖状胃切除术; 脂肪组织; 微囊蛋白1; 胰岛素抵抗; 内质网应激;

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