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FE-S域敲除的ABCE1基因过表达肺腺癌细胞株的建立及鉴定

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摘要

英文缩略语

前言

材料与方法

一、材料

二、实验方法

结果

一、对肺癌细胞系ABCE1蛋白表达水平的测定

二、质粒的构建与鉴定

三、细胞的转染

四、RT-PCR检测ABCE1的表达水平

五、Western blot检测ABCE1在蛋白水平的表达

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 ABCE1在真核生物中的作用

致谢

个人简介

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摘要

目的:
　　肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，肺癌的发病率和死亡率已跃居各类恶性肿瘤的首位。全世界范围内，肺癌的发病率与死亡率都呈上升趋势。目前肺癌的治疗以手术为主，放化疗结合，辅助以生物治疗、中医治疗等多学科的综合治疗。
　　ABCE1作为RNase L的抑制因子被发现，编码蛋白HP68又作为HIV-1病毒壳装备的必要宿主因子而出现。ABCE1蛋白在2-5A/RNase L通路上，对细胞抗病毒、细胞增殖、抗凋亡，进一步参与某些肿瘤的发生、发展、转移发挥着特定的作用。ABCE1对于真核生物蛋白翻译的起始、延长和终止，以及核糖体的回收充当着暂新的角色。
　　ABCE1含有一个由8个半胱氨酸残基组成的N端Fe-S域。N端Fe-S域的半胱氨酸残基通过与Fe离子形成两个反磁性Fe-S(4Fe-4S)域而发挥作用。最新研究表明，8个半胱氨酸残基中，7个半胱氨酸残基对Fe-S域的功能是必不可少的，其变异将导致细胞死亡。Fe-S域是体内多种酶发挥功能必不可少的结构基础，除了作为电子转运体外，还是铁离子的感受器，在蛋白自身稳定性调节和蛋白与核酸的结合及修饰过程起重要作用线粒体是Fe-S域合成的中心区域，Fe-S域在线粒体合成后转运至胞浆，然后再组装入蛋白。Fe-S域在核糖体在终止密码子的识别过程中发挥不可或缺的作用。
　　本实验为了进一步研究Fe-S域结构对ABCE1的作用，使用被敲掉Fe-S域的ABCE1基因转染入细胞，建立表达为残缺Fe-S域的ABCE1蛋白的细胞株，并予以鉴定。
　　方法:
　　1、使用Western blot检测多种肺癌相关细胞系的ABCE1在蛋白水平的表达，并选取两种表达有差异的细胞株作为转染细胞株。
　　2、构建Fe-S域缺失的pEGFP-C1-ABCE1质粒，并扩增、提取和鉴定。
　　3、Lipofectamin LTX and PLUS介导的细胞转染。
　　4、RT-PCR检测ABCE1在RNA水平的表达。
　　5、Western blot检测ABCE1在蛋白水平的表达。
　　结果:
　　1、同属肺腺癌的LTEP-a-2、A549细胞株的ABCE1表达差异明显，选为转染株，可以排除转染因细胞自身表达造成的差异。
　　2、质粒构建成功后扩增、提取和鉴定，结果符合实验预期。
　　3、细胞成功转染入细胞，在48h后荧光显微镜可见蓝色荧光。
　　4、在mRNA和蛋白水平上，Fe-S域缺失的实验组与过表达质粒全长对照组的表达无差异，与空载质粒阴性对照组和未转染空白对照组表达有明显差异。
　　讨论:
　　1、Fe-S域缺失的实验组ABCE1表达与过表达质粒全长对照组无差异，为解释进一步研究发现其细胞功能方面的差异提供了可能:可认为是Fe-S域缺失造成的结果，从而说明Fe-S域的在肿瘤中可能起到的功能。
　　2、最初想通过转染构建稳定表达Fe-S域敲除的ABCE1蛋白的肺癌细胞株，并利用G418进行细胞筛选，但实验2周发现只有转染pEGFP-C1组出现表达绿色荧光蛋白的阳性克隆，而其他组则无克隆形成，只有散在的细胞且生长状态较差，继续培养数天后仍然无阳性克隆形成，散在的细胞也出现凋亡的迹象。这可能与死亡细胞会裂解释放出有害物质，导致有表达的阳性细胞死亡;当细胞数目很少时，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡;或其他未知因素，其具体原因还有深入探讨研究。

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