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缓激肽诱发的钙触发钙释放调节脑微血管内皮细胞claudin-5的表达

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英文缩略语

论文一 原代脑微血管内皮细胞提取、培养以及鉴定

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

论文二 缓激肽刺激脑微血管内皮细胞产生CICR，内质网钙库IP3及尼诺丁受体参与此过程

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

论文三 缓激肽介导的CICR调节claudin-5的表达及分布，且此过程与屏障功能的改变密切相关

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 脑微血管内皮细胞钙离子变化(CICR)参与血脑屏障及血肿瘤屏障的开放进展

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摘要

目的
　　缓激肽(bradykinin，BK)是高分子量激肽原的产物，在血管内皮细胞舒血管素-激肽系统激活下，由前激肽释放酶裂变为激肽释放酶。与对照组生理盐水相比，小剂量缓激肽(10μg/kg/min)经颈动脉灌注的大鼠脑胶质瘤模型，可以显著地增加胶质瘤内血管的通透性;与此同时，正常的脑血管的通透性并未受到明显的影响。前期的数据已经证实缓激肽可以诱发脑胶质瘤细胞产生钙触发钙释放(calcium-inducedcalciumrelease，CICR)，后者参与到血肿瘤屏障开放中。进一步的研究显示，缓激肽可以诱发体外血脑屏障(blood-brainbarrier，BBB)模型的跨内皮电阻(transendothelialelectricalresistance，TEER)明显下降，这种联系与脑微血管内皮细胞钙离子升高又被进一步被证实。相关研究显示，钙离子本身诱发的钙离子释放叫做钙触发钙释放;IP3受体和尼诺丁受体参与到许多由CICR诱导的生理和病理过程中。而IP3受体与尼诺丁受体区别在于:钙离子单独存在就可以诱导尼诺丁受体介导的CICR，而IP3受体则需要额外的IP3的帮助才能触发CICR现象。
　　细胞内钙离子在细胞间的联系、TEER以及紧密连接蛋白ZO-1从细胞质向细胞膜移动发挥重要的作用，以及参与紧密连接的组成。一项Ca2+-ATPase的阻断剂胡萝卜毒素的实验中证实:紧密连接蛋白的完整性依赖于细胞内未经变化的钙库系统;此外，紧密连接在细胞膜的定位也依赖于胞内钙库的调节。但是，BK调节血肿瘤屏障的通透性的内在机制却不是十分清楚。因此，本实验的目的在于证实大鼠原代脑微血管内皮细胞是否存在CICR现象、CICR是否参与到claudin-5的表达，后者被认为是哺乳类动物血脑屏障中发挥最主要作用的屏障蛋白。
　　材料和方法
　　一、脑微血管内皮细胞的原代提取和培养
　　脑微血管内皮细胞来自于原代培养;C6胶质瘤细胞由中国医科大学神经生物教研室提供。本项试验中所有的步骤都符合中国医科大学动物实验伦理委员会的标准。4周龄Wistar大鼠脑皮质用滤纸去除脑膜组织;脑皮质用止血钳捣碎，混合0.1％2型胶原酶及50U/mLDnase放入37℃摇床消化40min。消化结束后，去除上清，加入20％BSA及DMEM重悬，室温离心1000g，20min以便于提取出血管段。收集血管段后，加入0.1％胶原酶/分散酶及50U/mLDnase，37℃消化40min。当血管段被消化肉眼不可见后，加入DMEM放入33％Percoll离心1000g，4℃，10min(33％Percoll液:Percoll原液9mL、10×PBS1mL、1×PBS19mL及FBS1mL)。离心去除胶原酶/分散酶后，加入完全培养基:高糖DMEM、20％PDS、4μg/mL嘌呤霉素（仅应用2天）、100μg/mL肝素、4ng/mLbFGF、10μg/mL内皮细胞生长支持物、2mML-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素以及0.25μg/nL两性霉素B。12小时后首次换液以去除未贴壁的细胞及血管段;放入37℃，5％CO2孵箱，每隔两天换液一次。
　　二、免疫荧光
　　当内皮细胞长满融合后，去除培养基，细胞用1×PBS冲洗3次。预冷100％乙醇用于固定兔抗大鼠血管第八因子抗体;4％多聚甲醛用于固定兔抗大鼠claudin-5，室温下固定30min。PBS冲洗3次后，0.1％TritonX-100细胞膜打孔5min，PBS清洗后加入5％BSA室温封闭30min。一抗用1％BSA封闭后放入4℃冰箱过夜。荧光二抗用1％BSA稀释后加入5μg/mLDAPI，室温孵育30min后PBS冲洗，上机。
　　三、WesternBlotAnalysis
　　蛋白质混合溶液用细胞刮刀收集，溶于PBS，1000R离心5min。去除上清后，加入裂解液，细胞溶液放置于冰上10min，震荡1min后，15，000g离心5min。收集上清，采用BCA试剂盒测试浓度。上样后，跑胶，转膜，脱脂奶粉室温封闭2小时。TBST洗膜3次（10min/次），一抗孵育过夜，第二天辣根过氧化物酶孵育后上机发光。
　　四、细胞内钙离子测定
　　用含有10μMfluo3-AM和0.02％PluronicF-127的DMEM溶液37℃避光孵育内皮细胞30min，然后用ACSF(126mMNaCl，3.75mMKCl，2mMCaCl2，1mMMgCl2，26mMNaHCO3，1.25mMKH2PO4，10mMglucose，pH7.4)溶液将多余的fluo3-AM清洗干净。药物刺激后细胞内钙离子的变化采用激光共聚焦显微镜在激发波长为488nm，发射波长为505nm的数值下测定。整个细胞的钙离子变化为％△F/F0，F0为细胞静息状态下的荧光变化，△F为变化后的数值与静息状态下数值的比值。
　　为了区分细胞核与细胞质钙离子的荧光变化。10μg/mLHoechst33342被用于标记内皮细胞核;同时，我们采用双通道来标记:一个通道用来标记整个细胞，另一通道来标记细胞核的荧光变化。细胞质的荧光变化为:整个细胞减去细胞核的荧光。为了观察IP3对细胞内钙离子的影响，我们采用20μMβ-escin来通透细胞膜与内质网膜30秒钟。
　　五、血肿瘤屏障的建立及通透性研究
　　使用前，用0.01％的鼠尾胶原包被多聚酯底膜，然后将其倒置于一个培养皿中，接种大鼠C6胶质瘤细胞与多聚酯膜的下面，细胞密度5×104/cm2，加入内皮专用培养基。24小时后将多聚底碟正常位置放于12孔培养板中，接种脑微血管内皮细胞与多聚酯膜上面。单层细胞旁路转运的功能评价采用荧光钠(分子量:376Da)，荧光钠100μg/mL在实验室的开始加入到上层小室，下层小室的吸光度用全波长酶标仪来测定。根据下层小室荧光钠的吸光度，通透性可以被计算。
　　结果
　　一、10-5M缓激肽诱发原代脑微血管内皮细胞产生钙触发钙释放;细胞外钙离子为钙离子波的先决条件
　　10-5M的缓激肽刺激脑微血管内皮细胞产生钙触发钙释放，形成峰值及平台期后逐渐恢复平稳。与10-5M的缓激肽相比，10-4M的缓激肽诱发一个平稳及持续的胞内钙离子升高，且升高的幅度后者要大于前者。为了证实细胞外钙离子是否参与到细胞内钙升高，我们去除了胞外钙离子后监测缓激肽刺激后细胞内钙离子变化。我们发现去除胞外钙离子后相同剂量的缓激肽无法触发胞内钙离子波，这个现象说明了胞外钙离子是CICR现象的先决条件和前提。
　　二、缓激肽通过细胞内质网IP3及尼诺丁受体介导钙触发钙释放的产生
　　应用100μM2-APB或尼诺丁后，10-5M缓激肽无法诱导BMECs产生CICR，细胞内钙离子水平骤然下降。此外，我们还发现不同于细胞质部位钙离子下降，细胞核的荧光强度反而在小范围内上升。应用18μMIP3或5mM咖啡因（内质网IP3受体及尼诺丁受体激动剂，可以促进内质网钙库向细胞质释放钙离子）后发现，上述两种药物促进和加强缓激肽诱导的CICR。有趣的是，2-APB或尼诺丁阻断内质网所形成的波形相似，而由IP3或咖啡因联合缓激肽触发的细胞内钙离子上升却是不同的:缓激肽结合IP3触发了一个缓慢的、持续上升的钙离子波形;而应用了咖啡因后细胞内钙离子快速上升，并达到一个峰值。根据以上的数据，我们得出结论:内质网的IP3受体及尼诺丁受体参与到缓激肽诱导的CICR之中。
　　三、应用缓激肽后，单一细胞内钙离子呈现不均一性（细胞质区域钙离子变化＞细胞核区域）
　　为了分别观察细胞质以及细胞核内的钙离子变化，我们采用细胞核染料Hoechst33342来标记细胞核。我们的实验结果进一步证实内质网的钙库参与到CICR中:应用缓激肽后，细胞质部位的钙离子荧光强度远远大于细胞核的荧光强度，但是细胞核的钙离子也非静止的，而是与胞质位置的变化趋势一致。
　　四、缓激肽通过钙触发钙释放调节claudin-5的表达及重新定位
　　应用10-5M缓激肽后，紧密连接蛋白claudin-5在10、20、30、40分钟时间点显著下降。为了进一步证实内质网钙库介导的CICR参与到claudin-5的调节之中，IP3、咖啡因、2-APB及尼诺丁应用于实验中。结果显示:IP3或是咖啡因，无论单独还是联合应用，可以进一步降低claudin-5的表达;而尼诺丁或是2-APB可以阻止（部分阻止）缓激肽诱导的claudin-5的下降。免疫荧光结果显示:与空白对照组相比，应用缓激肽后claudin-5大多内质化，或集中于细胞质部位;IP3及咖啡因可以加强上述这种现象;而2-APB及尼诺丁可以在一定程度上保持claudin-5在细胞膜上的定位。然而与尼诺丁相比较，2-APB作用甚微，因此我们怀疑内质网钙库尼诺丁受体在此过程中发挥主要作用。
　　五、缓激肽介导的claudin-5的变化与屏障功能的改变相一致
　　血肿瘤屏障的通透性用荧光钠来测定，空白对照组为4.37±0.21(10-6cm/s)，缓激肽及内质网钙库激动剂分别为:49.49±5.22(10-6cm/s)(10-5MBK)、65.46±2.17(10-6cm/s)(BK+IP3+caffeine)、61.39±1.61(10-6cm/s)(BK+caffeine)、58.77±3.95(10-6cm/s)(BK+IP3);缓激肽与内质网钙库阻断剂分别为:3.6±0.89(10-6cm/s)(BK+ryanodine)、3.24±0.4(10-6cm/s)(BK+2-APB)、2.61±0.71(10-6cm/s)(BK+ryanodine+2-APB)。内质网钙库激动剂以及缓激肽相比内质网钙库阻断剂高出十余倍，这证明缓激肽诱导的claudin-5表达变化是与屏障功能的改变一致的。
　　结论
　　1、缓激肽10-5M触发原代脑微血管内皮细胞钙离子波，细胞外钙离子是钙离子峰的前提和必要条件;此钙离子波属于钙触发钙离子释放机制。
　　2、钙离子敏感性的内质网IP3Rs及尼诺丁受体参与到缓激肽诱发的原代脑微血管内皮细胞的钙触发钙释放机制中。
　　3、内皮细胞经缓激肽处理后，细胞质区域的钙离子荧光强度大于细胞核部位的钙离子荧光强度，呈现不均一性;此现象进一步证实内质网钙库参与到CICR中。
　　4、缓激肽诱发的CICR增强时（应用内质网钙库激动剂如:IP3及咖啡因），紧密连接蛋白claudin-5表达显著下降及内质化;当缓激肽介导的CICR减弱时（应用内质网钙库阻断剂:2-APB及尼诺丁），claudin-5的内质化被完全或者部分阻止。因此，我们认为缓激肽介导的CICR是调节claudin-5的主要机制。
　　5、缓激肽参与的claudin-5表达下降与血肿瘤屏障功能的通透性改变相一致。

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