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Bardet-BiedL综合征蛋白质复合体BBSome在蛋白-蛋白相互作用调节及分子伴侣复合辅助下的组装

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　　 纤毛(cilium/cilia)是从一些原核细胞和真核细胞表面伸出的突起，由三个主要部分组成:中央轴丝、围绕它的质膜和一些细胞质。纤毛在脊椎动物体内的广泛存在可以解释当其结构或功能出现障碍时出现的复杂多样的疾病或表型。目前已知存在纤毛功能不全的有肾、视网膜组织以及神经管、发育中的肢体、胰腺、肝脏、脾、骨骼及中枢神经系统的一些部分。这些疾病因病因学及遗传学方面的重叠而被归入一个大类，统称为纤毛相关疾病(Ciliopathies)。日前的研究数据可帮助我们在这类疾病中发现新的基因突变，另外在认识纤毛相关疾病的症状方面也大有帮助。
　　 Bardet-Biedl综合征（Bardet-Biedl syndrome，BBS）是一种罕见的与纤毛相关的人类常染色体隐性遗传疾病，影响人体多个系统。其主要临床症状包括肥胖、视网膜色素变性、多指（趾）畸形、多囊肾、性腺发育不全、认知障碍、高血压及糖尿病等等。由于其多样的临床症状，使Bardet-Biedl综合征成为研究多种人类疾病分子机制的重要模型。到日前为止，共有16个BBS基因被报导，其中BBS1、2、4、5、7、8和9七种所编码的蛋白共同构成Bardet-Biedl综合征蛋白复合体BBSome。
　　 人们对BBSome组装过程的步骤、调节知之甚少。在体内，几乎所有的构成BBSome的蛋白都以BBSome复合体亚基形式存在，而极少见游离分子，这提示BBSome的组装过程进行的非常迅速，且各中间体存在时间极短。本研究对BBSome复合体组装的全过程进行了深入研究，尝试建立一个BBSome组装的模型。对BBSome组装过程的研究将给各亚基的功能研究奠定基础，并给BBSome的整体功能研究提供新的思路。
　　 材料及方法：
　　 1、克隆及亚克隆使用的菌株、载体、工具酶等
　　 大肠杆菌DH5α，克隆载体PSTBlue、 StrataClone，表达载体pCS2(+)-3xFlag、pCS2(+)-HA、 pCS2(+)-mycs、 pEGFP-N3/C3; Expand HiFi、Expand Long TemplateDNA合成酶;所有限制性内切酶（包括部分高保真版本）、T4 DNA连接酶、Klenow等来自NEB。所有点突变型质粒均使用QuickChangeⅡ site-directedmutagenesis试剂盒构建并经测序确认。所有相关人类及小鼠基因cDNA序列信息来自UCSC Genome Browser数据库，使用APE共享版软件及Sequencher4.8进行序列分析、内切酶选择、引物设计及测序结果对比筛选。
　　 2、本研究中应用的抗体
　　 兔抗人多克隆抗体BBS1、2、4、7，单克隆抗体anti-β-tubulin，多克隆抗体anti-β-actin，单克隆抗体anti-acetylated tubulin，单克隆抗体anti-γ-tubulin，兔抗人单克隆抗体anti-BBS8、9， thermolysin， and cycloheximide。羊anti-BBS2(C-16)。大鼠anti-TCP1a and TCP1b。兔anti-ubiquitin。 Smartpool RNAi against humanBBS2, BBS10, BBS12, BBS9。
　　 3、细胞培养及转染
　　 本研究使用的皮肤成纤维细胞取自(一)携带BBS10常见突变c91fs95的人类Bardet-Biedl综合征患者;另使用293T细胞及hTERT-RPE1细胞。转染使用lipofectamine2000或RNAiMAX。
　　 4、免疫荧光观察目的蛋白定位
　　 细胞以冷甲醇与固定后PBS洗涤封闭;封闭液中稀释日的蛋白标签—抗在窒温孵育后PBS洗涤;再次封闭，后以Alexa488或Alexa568标记的二抗孵育。最终以Vectashield mounting media containing DAPI裱片，并在荧光共焦显微镜下观察并拍摄。
　　 5、免疫共沉淀观察各蛋白质分子间相互作用
　　 使用不同标签的人类BBS基因被共转染入293T细胞。转染48小时后，裂解细胞、离心。取上清以protein G beads孵育。经孵育后的细胞裂解液再以标记有相应抗体的beads孵育，以裂解液洗涤后行Western Blot并以相应抗体检测。
　　 6、Western Blot检测蛋白表达水平
　　 取野生型及突变型雄性小鼠睾丸制备组织匀浆，Nanodrop蛋白定量。蛋白经电泳分离、电转至硝酸纤维素并以SuperSignal Dura extended substrate发光检测。
　　 7、蔗糖密度梯度离心
　　 小鼠组织制备组织匀浆，离心，上清转移至20-60％蔗糖梯度离心液，超速离心。取上清液并以冷丙酮沉淀，离心。沉淀以SDS-PAGE上样缓冲液溶解并以Western Blot检测。
　　 8、蛋白酶敏感性实验观察蛋白质稳定性及降解情况
　　 以分析液裂解细胞，等量蛋白与therolysin混合。终止反应后Western Blot检测，观察泛素化蛋白质降解途径下BBS蛋白的降解情况。
　　 9、小鼠
　　 本研究中应用了多个Bbs基因knock-in或knock-out小鼠。
　　 结果：
　　 1、BBS2、7、9首先形成一个三元亚复合体
　　 BBS2、7、9之间存在较强的相互作用，这种作用强于这三种蛋白与其他BBSome组分蛋白。该三元亚复合体成为整个BBSome的核心及其他亚基蛋白组装进入BBSome的平台。
　　 2、BBS1及BBS4最后装配入BBSome
　　 BBS1的最常见错意突变型蛋白M390R并不影响除BBS4之外BBSome其他亚基组装进入复合体，所有BBSome亚基蛋白中BBS1及BBS4最后装配入BBSome，BBS4的整合则依赖于BBS1的存在。
　　 3、BBS4的定位
　　 BBS4与PCM1的结合及定位于中心体/中心粒周围卫星体的过程不依赖于BBSome其它亚基，说明这一定位是BBS4分子的固有属性。
　　 4、BBS10的调节作用
　　 BBS10调节BBS7/12/6亚复合物及CCT/TRiC复合体之间的相互作用，且在整个BBSome的组装过程和功能调节中发挥重要作用。
　　 5、BBS7的释放
　　 BBS7从BBS分子伴侣复合体中释放后参与形成BBS7/2/9的三元亚复合物。BBS9整合入BBSome是与CCT/TRiC复合体脱离BBS2/BBS7的过程相藕连的。
　　 6、BBS2的稳定性
　　 BBS2的稳定性依赖于BBS2/BBS7/BBS9亚复合物、分子伴侣BBS蛋白及CCT/TRiC复合体。游离状态下的BBS2最终进入泛素化途径被蛋白酶体降解。
　　 结论：
　　 BBS2、7、9首先在BBS分子伴侣复合体的辅助下形成BBSome的核心三元复合体，而后BBSome的其他组分蛋白BBS1、5、8分别独立整合入BBSome，最后BBS4依赖于BBS1的存在组装进入复合体，成熟的BBSome组装完成。由此我们建立了一个完整的BBSome的组装模型。

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