两种BH3拟似物增强5-FU对人大肠癌细胞敏感性作用及机制研究

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　　大肠癌(colorectal cancer，CRC)是世界第三常见恶性肿瘤。5-FU是治疗大肠癌的重要化疗药物之一。虽然以5-FU为基础的化疗方案已经成为治疗大肠癌的重要途径，然而由于固有和获得性耐药问题导致仅有约25％的患者对5-FU治疗有效。虽然合用如奥沙利铂等药物能够增强5-FU的临床疗效，但这些疗法往往伴随着明显的不良反应并有约一半患者死亡。因此目前仍然迫切需要发展新的治疗策略以增强5-FU抗肿瘤效果。
　　BH3拟似物(BH3-mimetics)是以Bcl-2家族抗凋亡蛋白为靶点的小分子化合物。BH3拟似物通过破坏Bcl-2家族抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白间的由BH3结构域介导的相互作用诱导细胞凋亡。近年来，棉酚、apogossypol、ABT-737、ABT-263、TW-37、obatoclax、HA14-1等BH3拟似物已成为研究的热点。多项试验表明BH3拟似物能够通过恢复高水平表达Bcl-2家族抗凋亡蛋白的肿瘤细胞正常凋亡途径增强传统化疗敏感性。如棉酚可以提高紫杉醇对人类前列腺癌PC-3细胞的细胞毒作用。醋酸棉酚和地塞米松合用可明显增强后者促凋亡活性。棉酚同吉西他滨合用可以逆转高水平表达Bcl-2蛋白的细胞株对吉西他滨的耐药。在患者接受环磷酰胺-阿霉素-长春新碱-泼尼松龙(CHOP)方案治疗前给予棉酚可获得比单独应用CHOP方案或者棉酚更好的疗效。此外，棉酚被证明可增强地塞米松对多发性骨髓瘤细胞、环磷酰胺和美罗华对B细胞淋巴瘤移植瘤的治疗作用。这些研究表明，棉酚同与其他药物合用可以提高细胞毒效应，因此将棉酚同常见化疗药物合用于治疗耐药的肿瘤可能是一种新策略。BH3I-2'是一种人工合成的结构与Bak BH3肽链相似的小分子BH3拟似物。多项研究表明BH3I-2'通过同Bcl-2、 Bcl-XL结合诱导细胞凋亡。BH3I-2'也可增强某些抗肿瘤药物的敏感性。研究表明BH3I-2'可增加死亡受体5单克隆抗体TRA-8对乳腺癌细胞的治疗作用。BH3I-2'能增强胶质瘤细胞和前列腺癌细胞对TRAIL的敏感性。BH3I-2还可增强阿霉素和蛋白酶体抑制剂硼替佐米对Bcl-2蛋白过表达甲状腺肿瘤细胞的敏感性。
　　本实验拟通过研究两种BH3拟似物（棉酚、BH3I-2'）能否增加5-FU对大肠癌细胞的敏感性及探讨相关机制为大肠癌治疗提供新的策略和方法，同时进一步揭示BH3拟似物抗肿瘤作用的机理，为BH3拟似物用于肿瘤的治疗提供更多的实验依据。
　　方法：
　　1、采用MTT法测定5-FU、棉酚和BH3I-2'对细胞增殖抑制作用。
　　2、采用流式细胞术(PI单染法)进行细胞周期解析及凋亡判定。
　　3、采用Lipofectamine2000试剂进行瞬时转染。
　　4、采用Westemblot检测PARP、caspase-3，8，9、cyclin A、 cyclin D1、cyclin E、mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1、TS和TP蛋白的表达。
　　5、统计学处理:每次实验重复3次，数据以均数±标准差表示，两组间差异采用Student's t-test分析。P＜0.05有统计学意义。
　　结果：
　　1、MTT法测得棉酚作用于三种大肠癌细胞24小时和48小时的IC50值，HT-29细胞为44.22±1.02μmol/L和26.11±1.04μmol/L; HCT116细胞为24.92±1.08μmol/L和14.11±1.08μmol/L; RKO细胞为31.25±1.04μmol/L和21.83±1.05μmol/L;以不同浓度BH3I-2'作用于HCT116细胞24小时和48小时，以MTT法测得IC50值分别为107.5±1.27μmol/L和65.16±1.07μmol/L。不同浓度棉酚作用于HT-29细胞、RKO细胞和HCT116细胞48小时后，流式细胞术分析结果显示随着浓度增加亚二倍体凋亡峰(sub-G1峰)逐渐明显，细胞凋亡率逐渐增高，G0/G1期细胞比例逐渐增高。不同浓度棉酚作用于HT-29细胞、RKO细胞和HCT116细胞24小时后，westernblot法分析结果显示随着浓度增加凋亡相关蛋白PARP，caspase3，8，9裂解逐渐增多，细胞周期蛋白D1表达水平逐渐降低而细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白E表达水平无明显改变。不同浓度BH3I-2作用于HCT116细胞24小时后，以westernblot法检测结果显示随着浓度增加凋亡相关蛋白PARP、caspase3，8活化裂解程度逐渐增高，细胞周期蛋白D1表达水平逐渐降低而细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白E表达水平无明显改变。
　　2、分别以20μg/ml5-FU和20μmol/L棉酚作用于HT-29细胞，4μg/ml5-FU和10μmol/L棉酚在作用于HCT116细胞，2μg/ml5-FU和10μmol/L棉酚，4μg/ml5-FU和40μmol/L BH3I-2作用于HCT116细胞48小时，MTT法分析结果显示联合用药组细胞活力明显低于各单药组。流式细胞术分析结果显示联合用药组亚二倍体凋亡峰(sub-G1峰)及G0/G1期细胞比例明显高于各单药组。Westemblot法分析结果显示联合用药组凋亡相关蛋白PARP、caspase3活化裂解程度明显高于各单药组。此外，联合用药组细胞周期蛋白D1表达水平逐渐降低而细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白E表达水平无明显改变。
　　3、Westemblot法分析结果显示棉酚及BH3I-2'均以浓度依赖的方式下调大肠癌细胞TS蛋白表达水平。同时二者均能显著逆转5-FU诱导TS蛋白表达增多以及下调5-FU活性代谢产物氟尿嘧啶脱氧核苷(5-FdUMP)与TS、四氢叶酸共同形成的三元络合物水平。以瞬时转染siRNA法沉默TS蛋白表达可以增强单药5-FU或者联合用药组诱导HCT116细胞凋亡作用。单药棉酚，BH3I-2'或者同5-FU联合用药均对TP蛋白表达无明显作用。
　　4、Westernblot法分析结果显示棉酚及BH3I-2'单独应用或者同5-FU联合应用均可下调HCT116细胞和RKO细胞mTOR和S6K1蛋白磷酸化水平。 mTOR经典抑制剂雷帕霉素可显著地下调HCT116细胞和RKO细胞mTOR和S6K1蛋白磷酸化水平以及细胞周期蛋白D1和TS蛋白表达，而对TP蛋白、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白E表达水平没有明显影响，此作用同棉酚及BH3I-2'作用相似。
　　结论：
　　1、棉酚、BH3I-2'均以时间和浓度依赖性方式抑制大肠癌细胞增殖。棉酚及BH3I-2'均可通过激活内源性和外源性凋亡途径诱导大肠癌细胞凋亡。棉酚及BH3I-2'均可通过下调细胞周期蛋白D1表达水平引起细胞周期阻滞。
　　2、棉酚、BH3I-2'均可通过增强5-FU诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞作用增强5-FU对大肠癌细胞敏感性。
　　3、棉酚、BH3I-2'均可通过下调TS蛋白表达水平增强5-FU诱导大肠癌细胞凋亡作用。
　　4、棉酚、BH3I-2'无论是否同5-FU联合用药均不影响TP蛋白表达水平。
　　5、棉酚、BH3I-2'通过负性调控mTOR/S6K1通路下调TS蛋白和细胞周期蛋白D1表达作用。
　　6、棉酚、BH3I-2'通过负性调控mTOR/S6K1通路增强5-FU诱导大肠癌细胞凋亡作用。

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作者
杨丹;
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作者单位

中国医科大学;

展开▼
授予单位中国医科大学;
学科药学；药理学
授予学位博士
导师姓名冯婉玉;
年度 2013
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类抗肿瘤、抗癌药物;
关键词
大肠癌; BH3拟似物; 细胞敏感性; 抗肿瘤作用;

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