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富含半胱氨酸蛋白61在类风湿关节炎发病中的作用

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摘要

英文缩略语

论文一 类风湿关节炎患者血清及关节滑液Cyr61水平及临床意义

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文二 Cyr61在大鼠胶原诱导的关节炎(CIA)滑膜的表达

前言

一、材料和方法

实验结果

讨论

结论

论文三 阻断Cyr61蛋白活性对大鼠CIA病变的影响

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

本研究的创新性自我评价

参考文献

综述 Cyr61和炎症性疾病

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摘要

目的：
　　类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以多关节受累为主要表现的慢性自身免疫性疾病，其主要的病理表现包括滑膜细胞增生[1]，衬里层增厚，多种炎性细胞浸润，血管翳形成，以及关节软骨和骨组织的进行性破坏，最终导致关节畸形和功能障碍[2]。RA是人类致残率较高的疾病之一，可导致患者劳动能力的全部或部分丧失。目前RA的病因及发病机制尚未完全明确，故仍缺乏满意的治疗方法。因此，进一步了解RA发病机制并寻找安全、高效的治疗方法是目前亟待解决的难题。
　　富含半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich61，Cyr61)，又名CCN1，是CCN家族的成员。Cyr61是一种结构保守的具有多种功能的分泌型基质蛋白，具有明显的促有丝分裂活性和趋化性，可诱导成纤维细胞增殖和分泌细胞外基质，参与调节细胞增生、分化，在胚胎发育形成，软骨形成、血管生成及伤口修复中起作用，是生命活动的基本蛋白[6，11，22，35]。以往，Cyr61的研究多集中在肿瘤方面，研究发现Cyr61在不同肿瘤组织中的表达不一致且具有多重功能[16，18，19，35]，Cyr61通过促进肿瘤细胞增生、血管生成及影响细胞凋亡等过程参与肿瘤的发病。
　　滑膜细胞的分裂增加、凋亡减少及滑膜组织的血管增生等是参与RA发病的重要病理特点。近几年的研究发现，Cyr61参与了多种炎症性疾病如动脉硬化[40-42]、炎症性肠病[39]、类风湿关节炎[9,28,29]的发病过程，Cyr61可能通过促进细胞增生、增加病变组织血管生成，减少细胞凋亡等途径参与炎症性疾病的发病过程。本研究拟通过检测及分析RA血清及关节滑液中Cyr61的水平，并在胶原诱导的关节炎(collagen induced arthritis，CIA)大鼠模型上检测及分析Cyr61的表达情况，并通过Cyr61抗体的中和反应特异性的阻断Cyr61活性，观察对CIA发病的影响，及对凋亡调控因子bcl-2、bcl-xl及bax表达的影响，从而探索Cyr61在RA发病中的作用及通过Cyr61抗体阻断Cyr61在RA治疗中的价值。
　　方法：
　　1、ELISA方法检测血血清及关节滑液Cyr61水平
　　初治RA患者60例，健康对照者35例，采集空腹静脉血（无抗凝剂）2ml，4℃放置自然凝固后3000r/min离心20min，分离血清，分装后置于-80℃低温保存;有单侧或双侧膝关节积液的RA患者12例及有单侧或双侧膝关节积液的OA患者8例，常规方法采集膝关节滑液，4℃放置自然凝固后3000r/min离心10min，分离上清，分装后置于-80℃低温保存;集中用双抗体夹心ELISA方法检测血清及关节滑液的Cyr61水平，操作方法按试剂盒说明进行。
　　2、临床资料的采集
　　收集整理患者的临床及实验室检查资料。60例初治RA患者同时采集另一管全血1.6ml置于0.4ml3.8％枸橼酸钠抗凝管中，常规方法检测ESR;RA血清除检测Cyr61水平外，常规方法检测RF、抗CCP抗体及CRP水平。
　　3、建立胶原诱导的关节炎大鼠模型，应用RealtimePCR方法检测在初次免疫后第3、4、5周关节滑膜组织Cyr61mRNA表达水平，应用免疫组化及免疫印迹法定位、定量检测在初次免疫后第3、4、5周滑膜组织Cyr61蛋白表达情况，并观察Cyr61表达的动态变化规律及与关节炎指数、组织病理学评分等指标的关系。
　　4、大鼠尾静脉注射抗Cyr61单克隆抗体，观察其对胶原诱导的关节炎大鼠体重、关节炎指数、组织病理学评分及对凋亡调控因子bcl-2、bcl-xl及bax表达的影响，与正常对照比较，评价阻断Cyr61在RA治疗中的价值，探讨Cyr61滑膜细胞凋亡调控因子的影响，从而进一步探讨Cyr61在RA发病中的作用。
　　结果：
　　1.血浆及关节滑液Cyr61水平检测和分析
　　RA组的血清Cyr61水平高于健康对照组，差异有统计学意义(P＜0.01);早期RA组（病程≤6个月）的血清Cyr61水平高于非早期（病程＞6个月）RA组，差异有统计学意义(P＜0.05); RA组的关节滑液Cyr61水平高于OA组，差异有统计学意义(P＜0.05); RA的滑液Cyr61水平高于血清，差异有统计学意义(P＜0.05)。RA的血清Cyr61水平与RF水平正相关(r=0.362，P=0.017)，与血沉、CRP、抗CCP抗体、DAS28无明显相关性。
　　2、Wistar大鼠CIA发生率达80％左右。在初次免疫后2周左右大鼠开始出现关节炎表现，初次免疫后第4周关节肿胀达高峰，第5周部分大鼠出现关节强直，其临床过程及病理学变化与人类RA极其相似。
　　3、CIA大鼠关节滑膜mRNA及蛋白表达情况:realtime结果:CIA大鼠关节滑膜Cyr61mRNA的表达增加，初次免疫后3周、4周、5周与正常大鼠的Cyr61mRNA表达水平比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，尤其初次免疫后3周表达量最高，随后有下降趋势。免疫印迹法结果:CIA大鼠关节滑膜Cyr61蛋白表达增加，初次免疫后3周、4周、5周与正常大鼠的Cyr61蛋白表达水平比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，尤其初次免疫后3周表达量最高，随后有下降趋势，与mRNA的变化趋势一致。免疫组化结果:正常对照组Cyr61阳性染色滑膜细胞细胞少见，初次免疫后第3周Cyr61阳性染色滑膜细胞明显增加，随着病情的进展，第4周、5周时Cyr61阳性染色滑膜细胞有所减少。
　　4、应用抗Cyr61单克隆抗体阻断Cyr61可以明显减轻关节炎大鼠关节肿胀程度，大鼠体重增加，关节炎指数及组织病理学评分等指标与对照组比较明显改善;关节炎大鼠的关节滑膜的bcl-2及bcl-xl的mRNA水平及蛋白水平高于正常大鼠，抗Cyr61单克隆抗体治疗组的滑膜bcl-2及bcl-xl的mRNA水平及蛋白水平较PBS注射组减低，P＜0.05，差异有统计学意义。
　　结论：
　　1、RA患者血清及关节滑液Cyr61水平升高，尤其早期RA患者升高更为明显，提示Cyr61可能参与RA的发病，尤其参与RA发病的早期阶段。RA患者血清Cyr61水平与血清RF水平正相关，提示血清Cyr61阳性及高水平可能作为RA预后不良的一个标志。
　　2、CIA大鼠关节滑膜组织中Cyr61的mRNA和蛋白的表达都增加，提示Cyr61可能参与CIA的发病过程。
　　3、尾静脉注射抗Cyr61抗体可以改善CIA大鼠的关节炎指数及组织病理评分，并使CIA大鼠滑膜的抗凋亡因子bcl-2、bcl-xl的表达降低，提示Cyr61参与了RA的发病过程，而增加抗凋亡因子bcl-2、bcl-xl的表达可能是Cyr61参与RA发病的机制之一;阻断Cyr61的作用可能为RA治疗提供新的思路。

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