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Cygb基因过表达对氯化钻诱导的SH-SY5Y细胞缺氧损伤及对急性高眼压诱导大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护研究

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摘要

英文缩略语表

论文一 大鼠Cygb真核表达载体的构建

前言

材料与方法

结果

三、讨论

小结

论文二 Cygb的基因过表达对氯化钴诱导神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞缺氧损伤的神经保护作用

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

论文三 探讨Cygb基因过表达对急性高眼压诱导大鼠视网膜缺血再灌注损伤的神经保护作用

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

全文结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

在学期间科研成绩

致谢

个人简历

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摘要

视网膜是由大脑向外延伸的视觉神经末梢组织，其结构复杂、精细、脆弱而代谢旺盛。它是机体中耗氧最高的组织，其血管属于终末血管系统，任何病理性的破坏或血管梗阻等引起的组织缺血缺氧，均能导致组织坏死，丧失其感受和传导光刺激的功能。因此视网膜对缺血缺氧极为敏感[1]。
　　 缺血再灌注损伤是指组织器官在缺血的基础上，恢复血流后损伤反而加重的现象。在眼科常见于青光眼急性发作降眼压治疗中和影响视网膜血流的各种眼科手术过程中，以及视网膜血管阻塞性疾病的溶栓治疗过程中。视网膜缺血再灌注后可引起视网膜神经细胞坏死、凋亡，视网膜萎缩变薄，严重损害视功能，甚至导致永久性的视力障碍。[2-5]临床上常见的青光眼视神经病变、糖尿病性视网膜病变以及视网膜中央动静脉阻塞等疾病的发生都与缺氧有关系。组织的缺氧被视为视网膜血管疾病的重要原因，而与血管相关的视网膜疾病恰恰是临床上导致视力丧失的最主要原因。
　　 目前除了传统的手段治疗缺血缺氧性疾病，基因治疗已被认为具有广阔的应用前景。眼科基因治疗是将外源性目的基因转入相应的眼组织细胞内，使之安全有效的表达。目前基因转移的方式主要有病毒载体及非病毒载体。病毒载体可实现较高的转染效率，但其临床安全性和长期疗效仍需进一步验证[6]。非病毒载体的基因转染率不高，在体内尤为明显，其有效性有待实验验证[7]。因此，病毒载体的潜在危险或非病毒载体的低转染率使基因治疗的临床应用受到限制[8]。
　　 细胞红蛋白(cytoglobin， Cygb)是2002年由德国Burmester等发现的继血红蛋白(hemoglobin，Hgb)、肌红蛋白(myoglobin，Mgb)和脑红蛋白(neuroglobin，Ngb)之后的第四种携氧球蛋白。Cygb能够可逆性地结合氧，其能力与Ngb，Mgb近似，有与Mgb相似的携氧和储氧功能，并在Mgb不表达的组织中起作用[9,10]。Cygb可能通过清除缺氧时氧化应激状态产生大量具有损伤性的氧自由基，而对细胞产生保护作用。将N2a成纤维瘤细胞置于H2O2中，制造氧化应激模型，发现Cygb的mRNA水平显著上调，敲除Cygb基因，发现细胞对H2O2抵抗力下降，坏死增多[11]。将人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞暴露于H2O2诱导氧化应激模型，转染含有Cygb列的质粒至SH-SY5Y细胞以增强Cygb的表达，与对照组相比，细胞存活率显著提高，表明Cygb能够清除H2O2，保护细胞抵抗氧化应激诱导的细胞死亡[12]。在低氧低糖模型试验中，SH-SY5Y细胞内Cygb的表达强弱与局部的H2O2水平呈负相关[13]。
　　 Cygb在视网膜、外周神经和中枢神经细胞的胞浆和胞核中均存在。Cygb可能通过清除缺氧时氧化应激状态产生大量具有损伤性的氧自由基，而对细胞产生保护作用。在视网膜，Cygb主要分布于视网膜神经节细胞、内外丛状层、内核层及视网膜色素上皮细胞层，是线粒体密集区，说明Cygb与线粒体定位及氧耗具有相关性，因此认为Cygb可能参与高耗氧的视觉感受和视觉形成过程[14,15]。S.D.Grozdanic等指出Cygb在视网膜的作用可以促进氧弥散，提高氧从毛细血管向线粒体的流量，在正常及缺血缺氧条件下小量而持续地为组织供氧[16]。缺氧可以使Cygb表达上调，其可能作用在于强化细胞从细胞外获取氧，将氧传递给线粒体，从而保护细胞。参与了视网膜的氧运输及氧利用的Cygb与视网膜之间的相关性为缺血缺氧性视网膜疾病的研究带来了新的思路和方向。
　　 缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是迄今为止发现的唯一特异性缺氧状态下发挥活性的转录因子，是专一调节氧稳态的关键蛋白。大量研究表明，HIF-1是由一个α亚基（包括1α、2α、3α三种）和一个β亚基组成的异二聚体组成。其中HIF-1α的表达主要依赖于细胞间的氧供，是专一受氧调节的功能亚基，决定了HIF-1的活性。正常氧分压环境中细胞HIF-1α迅速通过泛素—蛋白酶体降解;当细胞氧分压降低时，HIF-1α在胞浆中积累活化，转移到细胞核与HIF-1β形成异源二聚体，并表现为缺氧时间和程度依赖性升高。因此，HIF-1α是在细胞和组织缺氧应答中居于核心地位的多功能转录因子。大量研究表明，HIF-1α在含氧量正常的脑组织中微量表达。急性缺氧时，大鼠脑组织中HIF-1α表达迅速增加，并聚集于细胞核内。
　　 SH-SY5Y细胞来源于人神经母细胞瘤，是一种分化程度较低的神经细胞肿瘤，其细胞形态与正常神经元相似。研究表明该细胞某些生理功能也与正常神经元有相似之处。铁鏊合剂氯化钻(CoCl2)是在国内外实验研究中广泛应用的化学缺氧的模拟剂，氯化钴导致细胞缺氧的机制主要是在常氧条件下模拟缺氧，二价钴离子可替代细胞表面血红素中的二价铁离子，阻断了氧信号，使细胞内处于乏氧状态，即化学乏氧。通过增加眼内压建立视网膜缺血再灌注损伤模型的制作方法是目前常用的研究视网膜缺血的方法，并在多种动物中应用。当眼压超过血管收缩压，眼内血液流动就会停止，引起视网膜局部或全部缺血，从而导致RGCs死亡，同时伴有视网膜神经纤维层变薄，严重程度与缺血的时间相关，当眼压下降后，血液重新灌注，损伤并没有终止，并持续加重，因此急性高眼压模型能有效地模拟视网膜缺血再灌注损伤的病理生理过程。
　　 pAcGFP1-C1是由绿色荧光蛋白(GFP)报告基因、SV40启动子、多克隆酶切位点和卡那霉素及新霉素抗性基因等组成。GFP具有在荧光显微镜下，用波长约488 nm的紫外线激发后，即可观察到绿色荧光的特性，易于构建融合蛋白，且融合蛋白后仍能保持荧光激发活性。
　　 基于上述研究结果，本研究首先采用带有绿色荧光蛋白的质粒pAcGFP1-C1作为载体，用基因工程的方法构建表达Cygb基因的重组质粒pAcGFP1-C1-Cygb，应用Lipofectamine2000将其转染至SH-SY5Y细胞及大鼠视网膜内使之过表达，探讨其在体外和体内实验中对神经细胞的保护作用。为缺血缺氧性视网膜疾病的基因治疗提供可靠的实验依据。
　　 目的:
　　 1、构建大鼠Cygb真核表达载体。
　　 2、研究Cygb表达对CoCl2诱导的SH-SY5Y细胞缺氧是否具有保护作用。
　　 3、探讨Cygb过表达对大鼠视网膜缺血再灌注损伤是否具有神经保护作用。
　　 方法:
　　 1、提取雄性SD大鼠脑组织总RNA，逆转录得到cDNA，PCR扩增Cygb基因CDS区573bp，基因两侧加入KpnⅠ/XbaⅠ酶切位点，首先对PCR产物进行测序，将得到的Cygb基因序列克隆入pAcGFP1-C1载体中，并通过双酶切和测序确定插入序列正确。
　　 2、贴壁培养SH-SY5Y细胞，用Lipofectamine2000将pAcGFP1-C1-Cygb质粒转染SH-SY5Y细胞，正常细胞加缺氧为对照组，pAcGFP1-C1-Cygb质粒转染组为实验组。加入一定浓度的氯化钴(250μmol/L)诱导细胞化学缺氧建立缺氧模型，按照加入氯化钴的时间不同分组。在诱导缺氧后0、6、12及24小时应用流式细胞仪检测不同组别细胞凋亡情况，在诱导缺氧后0、2、6、12及24小时应用Western blot检测各组Cygb、HIF-1α蛋白表达情况。
　　 3、9只SD大鼠，分为3组，每组3只（右眼用于HE染色，左眼用于TUNEL检测），分为生理盐水组、低剂量组（pAcGFP1-C1-Cygb1μl含Cygb2μg）、高剂量组（pAcGFP1-C1-Cygb1.5μl含Cgb3μg）。14天后处死动物，进行冰冻组织切片HE染色观察及TUNEL法检测。
　　 4、24只大鼠采用双眼玻璃体腔注射方式，随机分为4组。组1:生理盐水组;组2:Lipofectamine2000组;组3:Lipofectamine2000+ pAcGFP1-C1组;组4:Lipofectamine2000+ pAcGFP1-C1-Cygb组。48h后将上述建立大鼠视网膜缺血再灌注模型。术后24h处死大鼠。采用Western-blot方法测定Cygb（右眼）和HIF-1α（左眼）表达情况。
　　 5、24只大鼠采用双眼玻璃体腔注射方式右眼做为实验眼，左眼做为对照组，分为转染组(玻璃体腔注入Lipofectamine2000+ pAcGFP1-C1-Cygb)组和未转染组（玻璃体腔注入生理盐水），在转染后48小时，制作大鼠视网膜缺血再灌注模型，在再灌注2h、6h、12h、24h，比较转染组和未转染组caspase-3活性。
　　 统计学处理:采用SPSS11.5统计软件对数据进行统计学处理，所有数据资料均采用均数±标准差((x)±s)表示， P＜0.05为差异有统计学意义的标准。
　　 结果:
　　 1、SD大鼠Cygb真核表达载体构建情况:克隆了SD大鼠的Cygb基因，编码序列与参考序列完全一致。真核表达载体酶切片段和测序表明插入片段序列正确。
　　 2、SHSY5Y-GFP-Cygb细胞系转染情况:荧光显微镜结果宣示G418筛选后，得出稳定转染SHSY5Y-GFP-Cygb细胞系，在激发光波长为488nm左右光束激发后，发出绿色荧光。
　　 3、细胞活性比较:流式细胞仪结果显示随着缺氧诱导时间延长，未转染细胞与转染细胞组正常细胞所占比例与对照组相比，均显著减少（P＜0.01）;未转染细胞组与转染细胞组相比，有统计学差异（P＜0.01）。随着缺氧诱导时间延长，未转染细胞经缺氧诱导后，正常细胞比例由98.62±0.32％降至6h为74.17±0.91％，12h为68.47±0.84，至24h为49.29±0.93％，转染细胞经缺氧诱导后，正常细胞比例由99.11±0.38％降至6h为93.27±0.62％，12h为90.49±0.84，至24h为85.55±0.74％，转染组正常细胞比例明显高于未转染组;同时，随着缺氧诱导时间延长，未转染细胞与转染细胞组早期凋亡细胞所占比例与对照组相比，显著减少（P＜0.01);未转染细胞组与转染细胞组相比，有统计学差异（P＜0.01）。未转染细胞经缺氧诱导后，早期凋亡细胞比例由1.14±0.16％升高6h的22.67±0.72％，12h为27.3±0.95％，至24h为42.14±1.08％;转染细胞经缺氧诱导后，早期凋亡细胞比例由0.66±0.27％升高6h的6.31±0.29％，12h为7.21±0.5％，至24h为12.98±0.26％，与未转染组相比，转染组细胞存活率显著提高，表明Cygb能够保护细胞，减少细胞受缺氧诱导导致死亡，Cygb基因有效地转染至神经细胞并起到神经保护作用。
　　 4、Cygb和HIF-15表达情况:Western blot结果显示转染组Cygb表达水平明显高于未转染组。CoCl2诱导缺氧时，转染组和未转染组的Cygb、HIF-15表达在0～24小时逐步增加，呈时相性变化。
　　 5、caspase-3活性比较:转染组caspase-3活性显著低于未转染组。
　　 结论:
　　 1.SD大鼠脑组织中有Cygb表达，获得了Cygb基因的编码序列，并成功构建了Cygb真核表达载体。
　　 2.急性缺氧可以诱导Cygb及HIF-15表达上调。Cygb基因过表达对氯化钴诱导SH-SY5Y细胞缺氧损伤具有保护作用。
　　 3.Cygb过表达可以降低视网膜对缺氧的敏感性，起到神经保护作用。

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