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肿瘤细胞TRAIL-R1翻译后修饰和TRAIL-诱导凋亡的敏感性

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摘要

目的：
　　 用单淋巴细胞分析方法(ISAAC)方法,从TransChromo(TC)老鼠,提取出9种特异性结合人类TRAIL-R1的人免疫球蛋白G的单克隆抗体,并分类这9种TRAIL-R1特异性单克隆抗体,筛查抗体在TRAIL-R1相对应的表位。进一步,筛选对TRAIL治疗敏感性较高的肿瘤细胞类型和TRAIL治疗肿瘤较有效的细胞TRAIL-R1表位位点。探讨TRAIL和TRAIL-R1的表位构象和敏感性关系,帮助阐明TRAIL诱导凋亡机制,为应用TRAIL和TRAIL-R1信号靶向治疗恶性肿瘤提供有用资料。
　　 方 法
　　 ELISA竞争法分类TRAIL-R1特异性单克隆抗体以及该TRAIL-R1特异性抗体的可能表位。用流式细胞术,在Colo205、K562、Daudi、KMP4、MCF7等14种肿瘤细胞上继续分类和筛查TRAIL-R1特异性单克隆抗体在TRAIL-R1上的可能抗体表位。进一步用细胞生存能力分析,筛选TRAIL-R1抗体表位(TRl-272-、438-和419-表位),并选择对于细胞凋亡作用最强的TRAIL-R1抗体表位。接着,激光共聚焦显微镜分析和验证,所筛选的TRAIL-R1抗体表位在TRAIL结合之后可能发生的变化。进一步分析,各个细胞系TRAIL-R1 cDNA序列表达情况,检测各个细胞系TRAIL-R1的表达差异是否是因为各个细胞系TRAIL-R1碱基序列发生了变化。用衣霉素抑制各个肿瘤细胞TRAIL-R1的N-糖链或benzyl-α-GalNAc抑制肿瘤细胞合成O-糖链,继续用流式细胞术分析各个细胞系抑制TRAIL-R1糖链后的细胞染色结果。我们用Mann-Whitney's U-检验估计P值。
　　 结 果
　　 (1)ELISA竞争法推测9种TRAIL-R1特异性单克隆抗体在TRAIL-R1结合表位,从TR1-272抗体,TR1-419抗体,TR1-404和TR1-416抗体,TR1-407、417.和422-抗体,TR1--412和438-抗体之间,完全阻断、部分阻断或几乎不阻断等特点分析,推测出在重组体TRAIL-R1至少存在5种抗体表位。我们暂时将这些TRAIL-R1表位指定为TR1-272-、419-、416-、438-或417-表位。TR1-272-表位几乎被其他抗体竞争阻断,除了TR1-438-抗体。而TR1-438-表位不能被TR1-272-抗体竞争阻断,而被TR1-416和417-抗体部分竞争阻断。TR1-416-表位被TR1-272-和419-抗体阻断,而几乎不被TR1-417-和438-抗体阻断。TR1-417表位几乎不被TR1-272-、416-、419-和438-抗体阻断。TR1-419表位几乎被TR1-272抗体阻断,被TR1-417-和416-抗体部分阻断,而不被TR1-438抗体阻断。
　　 (2)下一步ELISA竞争法分析TRAIL-R1特异性单克隆抗体结合位点和在TRAIL-R1的TRAIL结合位点间的关系。结果显示TRAIL阻断TR1-417-和438-抗体和TRAIL-R1表位的结合,而几乎不阻断TR1-416-、419-和272-抗体的与TRAIL-R1表位的结合。这些结果显示,TR1-417-和438-表位位于TRAIL-结合位点或近处,TR1-272-、416-和419-表位可能位于TRAIL结合位点外侧。从竞争ELISA结果分析显示,TR1-272和438-表位是相互远离的。而抗体结合TR1-416-、417-和438-表位,较少相互干扰,TR1-417-和272-表位和TR1-416-、419-和272-表位是相互靠近的。
　　 (3)我们用流式细胞仪分析各个抗体在不同细胞系的结合情况。有趣的是,部分细胞系被TR1-404-、407-、416-、417-或422-抗体染色,而不被TR1-272-、419-、412-或438-抗体染色。这些结果证明,根据竞争ELISA结果分类抗体,符合细胞结合模式分类,在各个细胞系细胞表面TRAIL-R1抗体表位表达是不同的。TR1-416和417-表位在所有细胞系表达,表达TR1-416和417-表位的细胞系,不一定表达TR1-272、419-和438-表位。而有趣的是,Colo205、K562、Daudi和Du145细胞不表达TR1-272表位,而强烈表达其他抗体表位。
　　 (4)进一步,我们检测不同TRAIL-R1表位(TR1-272-、438-和419-表位)表达是否与TRAIL诱导肿瘤细胞系凋亡的敏感度相关。其中TR1-272-表位缺失的Colo205、K562、Daudi和Dul45肿瘤细胞比TR1-272-表位阳性的肿瘤细胞更容易被TRAIL诱导凋亡(p=0.0014)。与此对比,TR1-438-表位构象和TRAIL诱导的凋亡不相关(p=0.41)。TR1-419表位构象和TqLAIL诱导的凋亡也显示不相关。我们观察到一些抗体包括TR1-416抗体和TR1-419抗体,不和TRAIL竞争结合TRAIL-R1在这里,我们又检测了TRAIL和TR1-416抗体联合诱导肿瘤细胞凋亡。分析结果显示,TR1-416抗体明显增强了TRAIL对于诱导Colo205、K562和Daudi等肿瘤细胞的凋亡作用。总之,这些结果显示TR1-272抗体能够预测TRAIL在临床,用TRAIL治疗肿瘤时的敏感性。TR1-416抗体能够增强TRAIL诱导部分肿瘤细胞的凋亡作用。
　　 (5)为了解TRAIL诱导细胞死亡的不同敏感性调节机制,在TR1-272-表位阴性或阳性细胞系用TRAIL处理后,用激光共聚焦显微镜分析了细胞表面TRAIL-R1的情况。激光共聚焦显微镜检测结果显示,TRAIL作用后的TR1-272-表位阴性细胞,TRAIL-R1形成了大聚束,而TR1-272阳性细胞不能形成聚束。显示,TRAIL-R1寡聚化作用以及TR1-272-表位构象,可能影响肿瘤细胞对TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的敏感性。
　　 (6)进一步分析各个细胞系TRAIL-R1 cDNA序列表达发现,各个细胞系的TRAIL-R1氨基酸序列基本相同,因此说明各个细胞系表位表达差异不是发生在基因水平。(7)下一步继续分析TRAIL-R1的翻译后糖链修饰。在各个细胞,用衣霉素抑制TRAIL-R1的N-糖链或Benzyl-α-GaiNAc抑制合成O-糖链,继续用流式细胞术分析,是否各个细胞系TR1-272、419-或438-表位是否被蛋白质翻译后糖链修饰后出现了阴性或阳性染色表达。结果显示,O-糖链或N-糖链的抑制未能改变阴性表达率。观察到糖链对于TRAIL-R1表位的构象无影响,提示糖链可能对表位构象不起关键作用。
　　 结 论
　　 TR1-272-抗体可能识别TRAIL-R1构象,而这些构象能释放强大的细胞死亡信号。与此对比,TR1-438-、TR1-419-、TR1-416和TR1-417-表位构象与TRAIL诱导的凋亡不相关。TR1-416抗体能够明显增强TRAIL对于诱导Colo205、K562和Daudi等肿瘤细胞的凋亡作用。各个细胞系TRAIL-R1表位表达差异不是发生在基因水平,而TRAIL-R1翻译后糖链修饰可能对表位构象不起关键作用。进一步分析TRAIL表位构象和敏感性,可帮助阐明TRAIL诱导凋亡机制,并将为TRAIL和TRAIL-R信号治疗肿瘤提供有用资料。

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