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酵母核小体定位的理论预测及核小体体外组装的初步研究

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目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 引言

1.2 研究背景

1.2.1 核小体及核小体定位

1.2.2 核小体定位与基因表达调控

1.2.3 基因组上核小体定位的实验图谱

1.2.4 核小体定位的理论研究

1.2.5 酵母自主复制序列

1.2.6 核小体定位对自主复制序列ARS活性的影响

1.3 论文结构

第二章 理论方法

2.1 多样性与多样性增量

2.2 二次判别分析

2.3 支持向量机

2.4 预测算法的评价及检验

2.5 Pearson相关分析

第三章 核小体核心DNA和连接DNA序列的分类预测

3.1 引言

3.2 数据集

3.2.1 基因组数据的来源与提取

3.2.2 酵母核小体定位信息数据集的建立

3.3 特征值的选取

3.4 结果与讨论

3.4.1 ID-SVM算法分类预测酵母核小体核心DNA和连接DNA序列

3.4.2 ID-SVM算法分类预测果蝇和人类核小体核心和连接DNA序列

3.4.3 ID-SVM算法预测酵母核小体在基因组上的位置

3.5 小结

第四章 酵母核小体定位的全基因组预测

4.1 引言

4.2 数据集

4.3 特征值的选取

4.4 结果与讨论

4.4.1 IDQD算法分类预测酵母核小体核心DNA和连接DNA序列

4.4.2 IDQD算法预测酵母核小体在基因组上的位置

4.4.3 改进后的IDQD模型预测酵母核小体在基凶组上的位置

4.4.4 改进后的IDQD模型预测酵母功能区的核小体占据

4.5 小结

第五章 实验方法

5.1 酵母基因组的提取及检测

5.2 ARS304及两侧序列的PCR扩增及纯化

5.2.1 引物设计

5.2.2 PCR体系及反应条件

5.3 pRS405-ARS重组质粒的构建

5.3.1 载体的选择

5.3.2 连接反应

5.3.3 重组子的转化

5.3.4 重组子的筛选与鉴定

5.4 酵母组蛋白的提取

5.4.1 组蛋白的提取方法

5.4.2 组蛋白的检测

第六章 pRS405-ARS重组质粒的构建

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.2.1 实验材料

6.2.2 实验方法

6.3 结果与讨论

6.3.1 酵母基因组的提取

6.3.2 ARS304及两侧序列的PCR扩增

6.3.3 重组质粒pRS405-ARS304的PCR鉴定

6.3.4 重组质粒pRS405-ARS304的酶切鉴定

第七章 酵母组蛋白的提取

7.1 引言

7.2 材料与方法

7.2.1 实验材料

7.2.2 实验办法

7.3 结果与讨论

7.3.1 组蛋白的SDS-PAGE检测

7.3.2 组蛋白浓度的测定

第八章 总结和展望

8.1 工作总结

8.2 工作展望

参考文献

附录

致谢

作者攻读博士学位期间发表和完成的论文目录

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摘要

真核生物中负载着遗传信息的DNA分子在细胞中被包装成核小体。核小体不仅是构成真核生物染色质的基本结构单位,更重要的是通过它在基因组上的定位及其组蛋白复合物的化学修饰调控诸如转录、DNA复制和修复等基因表达过程。由于核心DNA被包装进核小体中,阻断了那些负责最基本生命过程的蛋白与DNA的接触机会,而核小体之间的自由区域更有利于这些蛋白因子的进入并识别结合位点,从而保证蛋白因子易于接近染色质模板。目前基于全基因组的核小体定位分析,发现基因组上核小体分布极不均匀,某些区域核小体占据率高,某些区域核小体缺乏。在基因间区与基因区(ORFs)相比,核小体更加稀疏;在基因的一些调控区,如启动子区、转录起始和终止位点、复制起始等区域,通常缺乏核小体。也有一些工作表明启动子区核小体的占据与其下游的基因表达效率呈负相关。因此,核小体在基因组上的位置对基因的表达调控是非常重要的。
   随着高通量实验技术的快速发展,目前已得到多种真核生物核小体定位的高分辨率实验图谱,但采用实验技术提取全基因组的核小体定位信息时,不仅耗费大量的时间和经费,而且对后续实验数据的分析也存在着局限。因此,基于现有的实验数据,发展核小体定位的理论预测模型已经成为了生物信息学领域的热点问题。
   真核生物复制起始的调控是复制调控的重要环节,ARS(Autonomously ReplicatingSequence)是酵母染色质复制所依赖的顺式作用元件。多项研究表明自主复制序列的结构影响其活性,且有不同活性的自主复制序列上的核小体分布不同。利用体外核小体重组技术研究核小体定位对ARS复制起始活性的研究有重要的生物学意义。
   本文基于酵母核小体序列信息发展了预测核小体定位的模型,并用于酵母全基因组核小体预测中,取得较好的预测效果。用分子生物学方法构建了含酵母ARS的重组质粒pRS405-ARS,采用酸抽提法提取酵母的组蛋白,为核小体的体外重组奠定了基础。主要研究内容如下:
   1.基于核小体序列中k-mer频数信息,采用多样性增量与支持向量机结合(ID—SVM)的方法对酵母核小体核心DNA和连接DNA序列进行分类预测,取得了较高的预测精度。在人类和果蝇的核小体核心DNA和连接DNA序列分类预测中也取得了较为理想的效果。
   2.基于核小体序列中k-mer频数信息和poly(A)信息,发展了预测核小体定位的IDQD模型,并将模型应用于酵母全基因组的核小体占据分析。在对转录起始位点(TSS)、转录终止位点(TTS)、复制起始序列(ARS)等功能区的核小体占据预测分析时IDQD模型也体现出良好的性能。
   3.比较了溶菌酶法、蜗牛酶过夜处理法、蜗牛酶反复冻融法、珠磨法等4种破壁提取酵母基因组DNA的方法;利用基本分子生物学方法将含酵母ARS304(ARS305)及其两侧序列与酵母穿梭质粒pRS405重组后,命名为pRS405-ARS。得到一系列含有ARS304(ARS305)及两侧不同长度序列的重组质粒。
   4.酸抽提法提取酵母细胞的组蛋白,这是核小体体外组装的基础。

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