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不同地区自然发酵乳制品中瑞士乳杆菌的多位点序列分型研究

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目录

1 引言

1.1乳酸菌

1.2瑞士乳杆菌

1.3 多位点序列分型(MLST)技术

1.3.1 MLST技术的概述

1.3.2 MLST技术在致病菌中的应用

1.3.3 MLST技术在真菌中的应用

1.3.4 MLST技术在乳酸菌中的应用

1.4 研究目的及意义

2 试验材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 菌种来源

2.1.2 试验试剂

2.1.3 仪器设备

2.1.4 数据分析处理软件

2.2 试验方法

2.2.1 菌株活化培养

2.2.2 基因组DNA的提取

2.2.3 基因组DNA的检测

2.2.4 持家基因的PCR扩增

2.2.5 测序及序列分析

2.2.6 生物信息学分析

3 结果与分析

3.1 DNA检测结果

3.2 持家基因扩增结果

3.3 11个持家基因PCR产物的测序结果

3.4 生物信息学分析结果

3.4.1 MLST分型结果

3.4.2 等位基因多样性分析

3.4.3 等位基因序列重组分析

3.4.4 eBURST分析结果

3.4.5 最小生成树分析结果

3.4.6 聚类分析结果

4 结论

致谢

参考文献

作 者 简 介

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摘要

本研究以分离自内蒙古、西藏、青海、云南、四川、甘肃、新疆和蒙古国自然发酵乳制品中的245株瑞士乳杆菌为研究对象,运用MLST技术,对11个持家基因(clpX,dnaA,dnaK,groEL,murC,murE,pepN,pepX,pyrG,recA和uvrC)进行双向测序获得高质量的目的序列,将其拼接、核对后构建等位基因图谱并获得序列型(sequence type,ST),然后运用生物信息学软件对等位基因的序列型和核苷酸序列的遗传进化多态性进行分析,进而分析菌株之间的系统遗传进化关系,结果表明:
  (1)11个持家基因的等位基因数量在5-18之间,其中uvrC具有最多的等位基因数(18个),而clpX仅有5个等位基因。运用START2.0软件算出11个持家基因的G+C含量处在35.91%(clpX)-46.30%(pepN)之间,多态位点数量在5(clpX)-80(pepX)之间,核苷酸多态性π值在0.00373(murE)-0.06233(pepX)之间,dN/dS在0.0255(pepX)-0.7614(clpX)之间,均小于1。
  (2)245株瑞士乳杆菌经分型得到108个STs,其中包含菌株数最多的序列型是ST-1(21株菌)。LIAN-Linkage软件分析显示瑞士乳杆菌群体存在一定的连锁不平衡(IAS=0.1948)。108个STs经过eBURST分析后,共形成8个克隆复合体(CC7、CC21、CC25、CC27、CC46、CC63、CC67和CC104)和27个独特型,其中CC27包含的瑞士乳杆菌分离株数最多,且CC27被认为是较为原始的克隆复合体。
  (3)通过最小生成树分析法对245株瑞士乳杆菌的遗传进化关系进行研究,结果表明,以分离地和分离源绘制最小生成树,其结构大致保持一致,均分为4个分支,然而,分离源较分离地与瑞士乳杆菌的种群结构形成具有更强的关联性。
  (4)系统发育分析结果表明,245株瑞士乳杆菌共分为3个遗传谱系,分别命名为酸马奶生态位群、酸牦牛奶-酸牛奶生态位群和混合型生态位群。分离自新疆的瑞士乳杆菌的序列型之间的遗传距离小,瑞士乳杆菌的进化时间短。瑞士乳杆菌在自然发酵乳制品的加工生产贮藏过程中,基因在选择压力的作用下发生变异,其中保守基因不易变异而被保留下来,形成自己独特的基因型。
  通过本研究初步建立起一种新的瑞士乳杆菌的分子分类学方法,分析了不同分离源瑞士乳杆菌的遗传背景,进而推演了瑞士乳杆菌的的进化过程,为瑞士乳杆菌的遗传进化和种群结构研究奠定了基础,同时丰富了瑞士乳杆菌的MLST全球数据库,为食品发酵剂的开发提供理论依据。

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