人乳头瘤病毒16型E7病毒癌基因干扰细胞周期调控与宫颈癌关系的研究——携带HPV16 E7癌基因重组腺病毒基因组的构建及鉴定

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目的:构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)E7病毒癌基因的重组腺病毒基因组，为重组腺病毒的包装打好基础，用于深入探讨E7干扰细胞周期调控的研究。　　方法:①采用氯仿-异戊醇抽提法提取临床证实为宫颈癌组织的DNA，PCR方法对所提DNA进行HPV16E7基因的筛选；②DNAStar软件辅助设计扩增HPV16E7基因全长片段的引物，并在其3'和5'端分别引入BglⅡ和HindⅢ酶切位点的，PCR技术从HPV16E7阳性的宫颈癌组织中获得目的基因片段；③构建携带目的基因(E7基因全长片段)的重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-E7；④限制性内切酶PmeⅠ线性化重组穿梭质粒，并用碱性磷酸酶去磷酸化处理后，QIAquickPCRPurificationKit进行酶切产物的纯化；⑤采用1×TSS两步法将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1转化E.coliBJ5183宿主菌，筛选阳性转化子，并鉴定；⑥将线性化的pAdTrack-CMV-E7转化新鲜制备的E.coliBJ5183感受态细菌(含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1)，利用RecA+宿主菌内的同源重组系统构建重组腺病毒基因组；⑦筛选转化子提取质粒并鉴定Ad-E7。　　结论:①采用PCR技术可以从HPV16E7阳性的宫颈癌组织DNA中扩增出E7病毒癌基因全长片段。②通过分子克隆技术可以构建携带HPV16E7病毒癌基因的重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-E7。③利用高效的1×TSS两步转化法可以制备含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的RecA+宿主菌EBJ5183。④利用AdEasyTMSystem以及BJ5183细菌内的同源重组系统可以构建携带HPV16E7病毒癌基因的重组腺病毒基因组Ad-E7。

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作者
黄丽丽;
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作者单位

青岛大学;

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授予单位青岛大学;
学科妇产科学
授予学位硕士
导师姓名戴淑真,罗兵;
年度 2005
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类女性生殖器肿瘤;人体病毒学（致病病毒）;
关键词
宫颈癌; 乳头瘤病毒; 重组腺病毒; E7基因; 穿梭质粒; 克隆;

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