DNa-PKcs对CD133阳性骨肉瘤细胞顺铂耐药性和骨肉瘤转移的作用及机制研究

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第一部分DNA-PKcs在骨肉瘤细胞和组织中的表达及其临床意义
　　研究背景
　　骨肉瘤是起源于恶性间充质细胞，以产生骨或骨样组织为特点的恶性肿瘤，是儿童和青少年中最常见的原发恶性骨肿瘤，发病率为4～5/100万。虽然接受手术结合化学治疗的骨肉瘤患者5年生存率可以达到50％-70％，然而近30年来，骨肉瘤患者的5年生存率无明显提高，而且已发生转移的患者5年生存率仅为20％-30％。因此，探索骨肉瘤发生和发展的机制，对改善治疗效果、提高患者生存率具有重要意义，具有一定的研究价值。
　　DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)是磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(PIKK)家族成员之一，它与异源二聚体复合物Ku70和Ku80共同组成DNA依赖性蛋白激酶复合体(DNA-PK)，主要通过非同源末端连接(NHEJ)的方式进行DNA双链断裂的修复，在维持基因组稳定中发挥着重要作用。除此之外，研究发现DNA-PKcs在人类细胞的功能活动中还发挥着诸多其他的生物学功能，如维持染色体端粒稳定、调节能量代谢、促进有丝分裂等。在多种恶性肿瘤中，DNA-PKcs的基因、蛋白表达水平或酶活性明显偏高，且与患者预后相关。但是，目前有关DNA-PKcs在骨肉瘤中的表达情况及其临床意义的研究较少，因此我们拟以骨肉瘤细胞和骨肉瘤组织为研究对象，探索DNA-PKcs在骨肉瘤中的表达及其临床意义。
　　研究目的
　　研究DNA-PKcs在骨肉瘤细胞和组织中的表达情况，及其表达与骨肉瘤临床特征的相关性，为后续研究DNA-PKcs在骨肉瘤中的生物学功能及其机制提供理论基础。
　　研究方法
　　1.采用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western Blot)方法分别检测人成骨细胞(hFOB1.19)和人骨肉瘤细胞(MNNG/HOS、MG-63、U2-OS、Saos-2)中DNA-PKcs的mRNA和蛋白表达情况。
　　2.采用细胞免疫荧光技术分别检测hFOB1.19细胞和MNNG/HOS、MG-63、U2-OS、Saos-2四种人骨肉瘤细胞中DNA-PKcs蛋白的表达位置和表达量。
　　3.采用免疫组织化学方法分别检测骨软骨瘤、骨肉瘤组织中DNA-PKcs蛋白表达情况，并分析骨肉瘤组织中DNA-PKcs蛋白表达与对应标本临床特征（性别、年龄、肿瘤部位、Enneking分期）的相关性。
　　研究结果
　　1.qRT-PCR和Western Blot结果显示，DNA-PKcs在四种人骨肉瘤细胞(MNNG/HOS、MG-63、U2-OS、Saos-2)中均有表达，而且其mRNA和蛋白在人骨肉瘤细胞中的表达水平均明显高于在人成骨细胞(hFOB1.19)中的表达水平（P＜0.05）。
　　2.细胞免疫荧光结果显示，DNA-PKcs蛋白主要在人骨肉瘤细胞(MNNG/HOS、MG-63、U2-OS、Saos-2)的核内表达，且比在hFOB1.19细胞中的表达水平高。
　　3.骨肉瘤组织中DNA-PKcs蛋白的阳性表达率显著高于骨软骨瘤组织(70.83％ vs5.00％，P＜0.05)，且DNA-PKcs蛋白在骨肉瘤中的表达与Enneking分期具有相关性，EnnekingⅢ期标本中DNA-PKcs蛋白阳性表达率显著高于EnnekingⅡ期标本(P＜0.05），而与患者年龄、性别、肿瘤部位无关(P＞0.05)。
　　结论
　　1.骨肉瘤细胞中DNA-PKcs的基因和蛋白水平高于人成骨细胞，DNA-PKcs蛋白主要在骨肉瘤细胞核内表达。
　　2.骨肉瘤组织中DNA-PKcs蛋白的阳性表达率显著高于骨软骨瘤，且DNA-PKcs蛋白的表达与骨肉瘤的Enneking分期相关。
　　关键词:骨肉瘤;DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位;Enneking分期
　　第二部分DNA-PKcs在CD133阳性MG-63细胞顺铂耐药性中的作用及其分子机制
　　研究背景
　　自辅助化疗应用到骨肉瘤治疗以来，骨肉瘤患者5年生存率已提高到50％-70％，然而近30年来，骨肉瘤的治疗效果已进入平台期。其中，化疗耐药是阻碍骨肉瘤治疗效果进一步提高的重要原因，因此有必要对骨肉瘤化疗耐药发生的机制展开进一步的研究。
　　在有关恶性肿瘤耐药的研究中，肿瘤干细胞理论受到人们越来越多的关注，该理论认为肿瘤干细胞除具有干细胞的一般生物学特性外，还具有更强的化学药物耐受性，在恶性肿瘤耐药中发挥着重要作用。现研究表明，骨肉瘤中CD133阳性细胞具有自我更新、多向分化、成瘤等肿瘤干细胞的生物学特性，且对化疗药物具有更强的耐受性。但是，目前对CD133阳性骨肉瘤细胞的耐药机制仍缺乏更为深入的研究。
　　DNA-PKcs的DNA损伤修复功能已被大量研究证明，它与异源二聚体复合物Ku70和Ku80共同参与，通过非同源末端连接的方式参与DNA双链断裂的修复。研究发现，DNA-PKcs可通过DNA损伤修复促进肿瘤细胞对化疗药物的抵抗，且DNA-PKcs在骨肉瘤肿瘤干细胞中高表达，因此DNA-PKcs是否可以通过DNA损伤修复导致骨肉瘤肿瘤干细胞耐药，值得研究。
　　P-糖蛋白(P-gp)是ATP结合盒(ABC)膜转运蛋白家族中的重要成员，可通过药物泵出功能降低细胞内药物浓度，增强肿瘤细胞对化疗药物的耐受性，而且它在骨肉瘤肿瘤干细胞中的表达明显高于在非肿瘤干细胞中的表达。尽管DNA-PKcs和P-gp在肿瘤耐药中都发挥着重要作用，且均在骨肉瘤肿瘤干细胞中高表达，但是有关DNA-PKcs是否可以通过调节P-gp的表达在骨肉瘤肿瘤干细胞耐药中发挥作用的研究还未见报道。另外，PI3K/Akt信号通路中活化的Akt可作用于核因子κB抑制蛋白激酶(IKK)，进而降解核因子κB抑制蛋白(IκB)，使核因子κB(NF-κB)进入细胞核内发挥功能。研究表明，NF-κB能够激活P-gp编码基因的启动子，促进基因的转录。因此我们推测，DNA-PKcs作为PI3K相关激酶(PIKK)家族中的一员，或许可以通过Akt/NF-κ信号通路调节P-gp的表达，从而增强骨肉瘤肿瘤干细胞的耐药性。
　　在该部分研究中，我们拟以CD133阳性MG-63细胞为研究对象，探索DNA-PKcs在骨肉瘤肿瘤干细胞顺铂耐药性中的作用及其分子机制。
　　研究目的
　　1.研究DNA-PKcs在CD133阳性骨肉瘤细胞顺铂耐药中的作用。
　　2.研究DNA-PKcs是否可以通过DNA损伤修复或调节P-gp的表达而影响CD133阳性骨肉瘤细胞顺铂耐药性。
　　研究方法
　　1.采用免疫磁珠分选的方法获取CD133阳性和阴性MG-63细胞，对比检测其对顺铂的耐受能力、DNA-PKcs的基因和蛋白表达情况;小干扰RNA(siRNA)下调CD133阳性MG-63细胞中DNA-PKcs的表达后，检测细胞顺铂耐药性的变化，以说明DNA-PKcs在CD133阳性MG-63细胞顺铂耐药中的作用。
　　2.顺铂作用后，对比检测CD133阳性和阴性MG-63细胞DNA损伤情况;siRNA下调CD133阳性MG-63细胞中DNA-PKcs的表达后，检测顺铂作用后DNA损伤的变化情况，以说明DNA-PKcs在CD133阳性MG-63细胞DNA损伤修复中的作用。
　　3.分别检测CD133阳性和阴性MG-63细胞中P-gp的基因和蛋白表达情况;采用P-gp抑制剂作用于CD133阳性MG-63细胞后，检测细胞顺铂耐药性的变化，以说明P-gp在CD133阳性MG-63细胞顺铂耐药中的作用。
　　4.下调CD133阳性MG-63细胞中DNA-PKcs的表达后，检测P-gp基因和蛋白水平的变化，以说明CD133阳性MG-63细胞中DNA-PKcs对P-gp表达的影响。
　　5.对比检测Akt/NF-κB信号通路在CD133阳性和阴性MG-63细胞中的活性;采用抑制Akt活性或下调NF-κB表达的方法抑制Akt/NF-κB信号通路的活性后，检测P-gp基因和蛋白水平的变化，以说明CD133阳性MG-63细胞中Akt/NF-κB信号通路对P-gp表达的影响。
　　6.下调CD133阳性MG-63细胞中DNA-PKcs的表达后，检测Akt/NF-κB信号通路活性的变化，以说明CD133阳性MG-63细胞中DNA-PKcs对Akt/NF-κB信号通路活性的影响。
　　研究结果
　　1.与CD133阴性MG-63细胞相比，CD133阳性MG-63细胞对顺铂具有更强的耐药性且DNA-PKcs mRNA和蛋白均高表达。然而，下调CD133阳性MG-63细胞中DNA-PKcs的表达后，细胞对顺铂的耐受性降低。该结果说明，DNA-PKcs在CD133阳性MG-63细胞顺铂耐药中发挥着促进作用。
　　2.与CD133阴性MG-63细胞相比，CD133阳性MG-63细胞在接受顺铂作用后产生的DNA双链断裂较少。但是，下调DNA-PKcs的表达后，CD133阳性MG-63细胞DNA损伤修复能力降低，接受顺铂作用后DNA双链断裂增加。以上结果说明，DNA-PKcs可通过DNA损伤修复增强CD133阳性MG-63细胞的顺铂耐药性。
　　3.与CD133阴性MG-63细胞相比，CD133阳性MG-63细胞中P-gp mRNA和蛋白均高表达;抑制P-gp作用后，CD133阳性MG-63细胞的顺铂耐药性显著降低。该结果说明，P-gp具有增强CD133阳性MG-63细胞顺铂耐药性的作用。
　　4.下调CD133阳性MG-63细胞中DNA-PKcs的表达后，P-gp mRNA和蛋白表达水平均降低，即DNA-PKcs参与P-gp的表达。
　　5.与CD133阴性MG-63细胞相比，Akt/NF-κB信号通路在CD133阳性MG-63细胞中处于活化状态;抑制Akt/NF-κB信号通路可以降低CD133阳性MG-63细胞中P-gp的基因和蛋白水平;下调DNA-PKcs可以降低CD133阳性MG-63细胞中Akt/NF-κcB信号通路活性。以上结果说明，DNA-PKcs可以通过Akt/NF-κB信号通路调节P-gp的表达，从而增强CD133阳性MG-63细胞顺铂耐药性。
　　结论
　　1.DNA-PKcs在CD133阳性MG-63细胞中高表达且具有增强细胞顺铂耐药性的作用。
　　2.DNA-PKcs可以通过DNA损伤修复和经Akt/NF-κB信号通路调节P-gp的表达，发挥增强CD133阳性MG-63细胞顺铂耐药性的作用。
　　关键词:骨肉瘤;肿瘤干细胞;DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位;P糖蛋白;耐药性
　　第三部分DNA-PKcs在骨肉瘤转移中的作用及其分子机制
　　研究背景
　　骨肉瘤具有较高的转移发生率，最常见的转移部位为肺脏，远处转移是骨肉瘤患者死亡的主要原因。发生转移的骨肉瘤患者预后较差，据统计，已发生远处转移的患者5年生存率仅为20％-30％。因此，有必要对骨肉瘤转移的发生和发展机制进行研究，以减少远处转移的发生、提高患者生存率。
　　DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)作为磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(PIKK)家族成员之一，可以通过调节下游靶基因的转录，参与细胞的生存、炎性反应、代谢调节、细胞凋亡和细胞周期等多种功能活动。研究表明DNA-PKcs在多种恶性肿瘤中高表达且与预后相关，而且在论文第一部分中我们也发现DNA-PKcs在骨肉瘤中高表达且与Enneking外科分期相关。但是，目前能够明确证明DNA-PKcs在肿瘤转移中的作用研究甚少，且尚无有关DNA-PKcs与骨肉瘤转移之间关系的报道。在该部分中，我们将探索DNA-PKcs在骨肉瘤转移中的作用。另外，基质金属蛋白酶2(MMP2)和磷酸化的肌球蛋白轻链2(p-MLC2)分别可以通过降解细胞外基质和增强肌动蛋白-肌球蛋白收缩，直接影响细胞的运动能力，而且研究发现MMP2和p-MLC2的表达均与Rho/ROCK信号通路有一定关系。因此，我们推测DNA-PKcs或许可以通过Rho/ROCK信号通路调节MMP2和p-MLC2的表达，从而在骨肉瘤转移中发挥作用。
　　在该部分研究中，我们拟以骨肉瘤细胞为研究对象，通过体外和体内实验探索DNA-PKcs在骨肉瘤转移中的作用及其分子机制，从而为针对DNA-PKcs的靶向治疗在骨肉瘤转移治疗中的应用提供一定的理论基础。
　　研究目的
　　1.研究DNA-PKcs对骨肉瘤细胞体外迁移和侵袭能力、体内转移瘤形成和发展的影响。
　　2.研究DNA-PKcs是否可以通过Rho/ROCK信号通路调节MMP2和p-MLC2的表达，从而在骨肉瘤转移中发挥作用。
　　研究方法
　　1.采用DNA-PKcs特异性抑制剂NU7026作用于骨肉瘤细胞(MNNG/HOS细胞、MG-63细胞、Saos-2细胞、U2-OS细胞，下同)后，采用细胞划痕实验、Transwell细胞迁移实验检测骨肉瘤细胞迁移能力的变化，采用Transwell细胞侵袭实验检测骨肉瘤细胞侵袭能力的变化，以说明DNA-PKcs在骨肉瘤细胞体外迁移和侵袭中的作用。
　　2.采用DNA-PKcs siRNA慢病毒载体感染骨肉瘤细胞后，荧光显微镜下观察病毒感染效率，并采用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western Blot)实验分别检测DNA-PKcs mRNA和蛋白水平的变化情况，以评价siRNA的沉默效果。
　　3.采用DNA-PKcs siRNA慢病毒载体感染骨肉瘤细胞，下调DNA-PKcs表达后，Western Blot检测细胞中MMP2和p-MLC2蛋白水平的变化，酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞上清中MMP2分泌的变化，以说明DNA-PKcs对MMP2和p-MLC2表达的调节作用。
　　4.下调DNA-PKcs表达后，检测骨肉瘤细胞中具有生物活性的RhoA-GTP酶表达水平的变化，采用qRT-PCR和Western Blot分别检测骨肉瘤细胞中ROCK1、ROCK2的基因和蛋白表达水平的变化，以说明DNA-PKcs对RhoA/ROCK信号通路的调节作用。
　　5.采用ROCK2特异性抑制剂SLx-2119作用于骨肉瘤细胞后，同样采用细胞划痕实验、Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移能力的变化，采用Transwell细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化，以说明RhoA/ROCK2信号通路在骨肉瘤细胞体外迁移和侵袭中的作用。
　　6.在骨肉瘤细胞中，采用脂质体转染siRNA下调ROCK2表达后，WesternBlot检测细胞内MMP2和p-MLC2蛋白水平的变化，ELISA检测细胞上清中MMP2分泌的变化，以说明RhoA/ROCK2信号通路对MMP2和p-MLC2表达的调节作用。
　　7.将阴性对照siRNA和DNA-PKcs siRNA慢病毒载体分别稳定感染MNNG/HOS细胞后，经尾静脉注入NOD/SCID小鼠体内，建立骨肉瘤转移模型，继续饲养，并观察、记录小鼠一般生长情况，10周后对比两组小鼠体内转移病灶形成率、转移病灶体积。
　　研究结果
　　1.DNA-PKcs抑制剂NU7026作用于骨肉瘤细胞后，细胞的迁移和侵袭能力明显降低，与阴性对照组相比，具有统计学差异（P＜0.05），说明DNA-PKcs具有促进骨肉瘤细胞体外迁移和侵袭的作用。
　　2.按照合适的MOI值，DNA-PKcs siRNA慢病毒载体感染四种骨肉瘤细胞，感染效率均可达80％以上。qRT-PCR和Western Blot结果显示，与感染阴性对照siRNA慢病毒载体的细胞相比，感染DNA-PKcs siRNA慢病毒载体的骨肉瘤细胞中DNA-PKcs mRNA和蛋白水平均显著降低(P＜0.05)，DNA-PKcs基因沉默效果满意。
　　3.下调DNA-PKcs表达后，骨肉瘤细胞中MMP2和p-MLC2蛋白表达水平显著降低，细胞上清中MMP2的分泌量显著减少(P＜0.05)，说明DNA-PKcs可以通过调节MMP2和p-MLC2的表达参与骨肉瘤细胞体外迁移和侵袭。
　　4.下调DNA-PKcs表达后，具有活性的RhoA-GTP酶表达降低，且ROCK2在mRNA和蛋白水平均有下降，与阴性对照组相比，具有统计学差异（P＜0.05），说明DNA-PKcs对RhoA/ROCK2信号通路具有调节作用。
　　5.采用ROCK2抑制剂SLx-2119作用于骨肉瘤细胞后，细胞体外迁移和侵袭能力均显著降低(P＜0.05); siRNA下调ROCK2表达后，细胞中MMP2和p-MLC2蛋白的表达显著降低，细胞上清中MMP2的分泌量显著减少(P＜0.05)。该结果说明，RhoA/ROCK2信号通路可以通过MMP2和p-MLC2促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。
　　6.与阴性对照siRNA慢病毒载体感染的MNNG/HOS细胞相比，DNA-PKcssiRNA慢病毒载体感染的MNNG/HOS细胞在NOD/SCID小鼠体内形成的转移病灶数量明显减少，且肿瘤平均体积减小，两组相比具有统计学差异(P＜0.05）。该结果表明，DNA-PKcs具有促进骨肉瘤体内转移形成和发展的作用。
　　结论
　　1.DNA-PKcs具有促进骨肉瘤细胞体外迁移和侵袭、体内转移瘤形成和发展的作用。
　　2.DNA-PKcs可以通过RhoA/ROCK2信号通路调节MMP2和p-MLC2的表达，促进骨肉瘤细胞转移。
　　关键词:骨肉瘤;DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位;转移;RhoA/ROCK2信号通路

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作者
李卡;
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作者单位

山东大学;

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授予单位山东大学;
学科外科学（骨外）
授予学位博士
导师姓名李建民;
年度 2017
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正文语种中文
中图分类骨骼肿瘤;
关键词
骨肉瘤; 发病机制; 顺铂耐药性; 信号通路; 肿瘤转移;

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