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黄翅大白蚁后肠细菌来源木聚糖酶的纯化与基因克隆以及培菌白蚁菌圃微生物多样性研究

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摘要

第一章 绪论

1.1 白蚁

1.1.1 白蚁概述

1.1.2 培菌白蚁的研究

1.1.3 白蚁共生微生物

1.2 培菌白蚁与木质纤维素降解

1.2.1 培菌白蚁肠道共生微生物与木质纤维素降解

1.2.2 培菌白蚁体外共生真菌与木质纤维素降解

1.3 木聚糖酶

1.3.1 木聚糖酶的种类及应用

1.3.2 白蚁相关木聚糖酶的研究进展

1.4 本文立提依据与研究内容

1.4.1 立题依据

1.4.2 研究内容

第二章 黄翅大白蚁后肠Paenibacillus sp.Mb1由来木聚糖酶的纯化和基因克隆

2.1 引言

2.2 实验材料、试剂与仪器

2.2.1 样品

2.2.2 培养基与主要试剂

2.2.2 试剂与实验器材

2.3 实验方法与步骤

2.3.1 木聚糖酶的产生

2.3.2 木聚糖酶的测定

2.3.3 葡萄糖标准曲线的测定

2.3.4 微量蛋白质标准曲线的绘制

2.3.5 胞外木聚糖酶XylMb1的纯化

2.3.6 木聚糖酶XylMb1酶活性质分析

2.3.7 木聚糖酶基因XylMb1的克隆

2.4 实验结果

2.4.1 DNS法测葡萄糖标准曲线

2.4.2 蛋白标准曲线的绘制

2.4.3 木聚糖酶的纯化结果

2.4.4 木聚糖酶性质鉴定

2.4.5 木聚糖酶基因XylMb1的克隆

2.5 讨论

2.6 小结

第三章 黑翅土白蚁菌圃微生物多样性的研究

3.1 引言

3.2 实验材料

3.3 实验步骤

3.3.1 菌圃总基因组的提取及PCR扩增

3.3.2 高通量Miseq测序

3.3.3 数据优化与统计

3.3.4 生物信息分析流程

3.4 实验结果

3.4.1 菌圃的采集

3.4.2 数据优化与统计

3.4.3 菌圃中细菌OTU稀释性曲线分析

3.4.4 菌圃中细菌在科水平上的分类

3.4.5 菌圃中细菌在属水平上的分类

3.4.6 菌圃真菌OTU稀释性曲线分析

3.4.7 菌圃中真菌多样性存科水平上的分类

3.4.8 菌圃中真菌多样性在属水平上的分类

3.5 讨论

3.6 小结

第四章 结论与展望

附录

参考文献

致谢

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摘要

白蚁在自然生态系统中是生物质转化的重要群体,在未对木材进行物理和化学的特殊处理情况下,白蚁可以将木质纤维素转化为自身生存所需要的营养和能量,是相对温和且高效的一个转化系统。白蚁对于木质纤维素的高效降解与其共生微生物和环境是息息相关的,根据白蚁后肠共生原生动物的有无,可以分为低等白蚁(有共生原生动物)和高等白蚁(无共生原生动物)两大类群。目前认为低等白蚁是通过内源纤维素酶(白蚁自身分泌)和外源纤维素酶(共生微生物分泌)的双重纤维素降解机制完成降解过程,而占白蚁总种类的75%的高等白蚁的降解机制则复杂的多。
  培菌白蚁(Fungus-growing termites)属于高等白蚁科(Termitidae)、大白蚁亚科(Macrotermitinae),因与鸡枞菌属(Termitomyces)真菌共生而得名。这类白蚁主要分布于亚洲和非洲的热带及亚热带地区。因为能够特异性在白蚁巢内培养担子菌科的蚁巢伞菌属的真菌并以其为食,因此就构成了白蚁自身、体外真菌和肠道微生物的木质纤维素降解的共生体系。而这种降解模式也是现在对于高等培菌白蚁木质纤维素降解机制研究的一个热点所在。为了了解高等培菌白蚁肠道微生物和白蚁共生菌圃在木质纤维素降解过程的作用,本文以培菌白蚁为研究对象,做了以下研究:
  首先对于黄翅大白蚁后肠来源类芽孢杆菌-Mb1产生的木聚糖酶进行了蛋白质纯化,通过硫酸铵沉淀,阴离子交换柱,疏水作用柱,分子筛纯化,最终得到了条带单一的蛋白,命名为XylMb1,XylMb1是一种木聚糖内切酶,分子量为20 kDa,是目前报道的分子量较小的木聚糖酶,证明了高等培菌白蚁后肠微生物对于木质纤维素的降解潜力,同时我们成功的得到了木聚糖酶基因XylMb1。
  其次利用16 S rRNA的高通量测序对黑翅土白蚁不同形成时间的菌圃微生物的多样性进行分析:首先,菌圃微生物种类比较少,其中优势菌群为拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门,拟杆菌门细菌所占比例远大于黑翅土白蚁肠道中该菌所占比例,拟杆菌门的细菌可能会起到为宿主提供丰富氮源的作用,还发现了黑翅土白蚁肠道未检测到的螺旋菌门的细菌;其次,理研菌科和紫单胞菌科这两类菌在黄翅大白蚁后肠中为优势菌群,其中所占细菌比例比较接近于形成时间短的Fungus Comb2中二者的比例;最后,形成时间较长的菌圃具有相对较多的拟杆菌科、毛螺旋菌科、红螺菌科和α-变形杆菌科的细菌,而形成时间较短的的菌圃细菌种类较多,除了含量为36.32%的理研菌科的细菌,还具有了一些无胆甾原体科、暖绳菌科、硝化螺菌属、红螺菌科的细菌;同时这两种菌圃中共生真菌-鸡枞菌的大量存在证明了该真菌是培菌白蚁生存必不可少的一部分,不论是作为食材还是在木质素、糖类的降解方面。对于黑翅土白蚁菌圃微生物多样性的分析充实了我们对于白蚁生活环境的认识。
  总之,本论文以培菌白蚁为研究对象,纯化和分析了黄翅大白蚁后肠来源-类芽孢杆菌Mb1产生的木聚糖酶的性质,并得到了木聚糖酶基因XylMb1;同时通过16S rRNA的高通量测序对黑翅土白蚁不同形成时间的菌圃微生物的多样性进行分析,丰富了我们对于白蚁生活环境的认识。

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