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济南水环境中喹诺酮耐药细菌的筛选及其质粒介导的喹诺酮耐药基因的检测

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第一章 前言

1.1 喹诺酮类抗生素介绍

1.1.1 喹诺酮类抗生素的作用机制

1.1.2 喹诺酮类抗生素的发展历程

1.2 细菌对喹诺酮类抗生素的耐药机制

1.2.1 染色体编码的喹诺酮耐药性

1.2.2 质粒介导的喹诺酮耐药性

1.3 喹诺酮类抗生素滥用的危害与对策

1.3.1 喹诺酮类抗生素的滥用

1.3.2 解决对策

1.4 整合子-基因盒系统

1.4.1 整合子

1.4.2 基因盒

1.5 立题依据和意义

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株

2.1.2 药品与试剂

2.1.3 实验器材

2.1.4 培养基

2.2 实验方法

2.2.1 采样及喹诺酮耐药细菌的筛选与保存

2.2.2 CTAB法提取细菌总DNA

2.2.3 琼脂糖凝胶电泳

2.2.4 提取DNA的质量检测

2.2.5 质粒介导的喹诺酮耐药基因的检测

2.2.6 qnr基因的水平转移性分析

2.2.7 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型整合子的检测

2.2.8 含有整合子的耐药细菌中基因盒阵列的检测

2.2.9 DNA片段切胶回收

2.2.10 琼脂纸片扩散法(K-B法)细菌药物敏感试验

第三章 结果与讨论

3.1 耐药细菌的筛选

3.2 提取细菌总DNA的质量检测

3.3 质粒介导的喹诺酮耐药基因的检测

3.3.1 质粒介导的喹诺酮耐药基因的检出情况

3.3.2 qnr基因水平转移性试验

3.4 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型整合子及其可变区基因盒的检测

3.4.1 整合子的检测

3.4.2 基因盒的检测

3.4.3 接合转移子的整合子-基因盒的检测

3.5 琼脂纸片法(K-B法)药敏试验

第四章 全文总结

参考文献

致谢

学位论文评阅及答辩情况表

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摘要

抗生素的发现是二十世纪人类取得的重大医学成就之一,是人类对抗细菌的最有力武器。然而随着抗生素的大量使用甚至是滥用,环境中细菌的耐药率不断攀升,多种病原菌获得了耐药性后大有卷土重来之势,特别是能够对抗几乎所有现有抗生素的“超级细菌”的出现,似乎使人类再次陷入无抗生素时代。针对细菌的耐药性问题,加强抗生素使用管理,只能延缓细菌耐药性的泛滥。
  只有对细菌的耐药机制进行深入的研究,才能够做到知己知彼、对症下药,真正了解并控制细菌的耐药问题。
  细菌的喹诺酮耐药机制主要分为染色体介导的耐药性和质粒介导的耐药性(PMQR),后者对细菌耐药性的广泛传播有重要作用。本文主要对细菌质粒介导的喹诺酮耐药机制进行了研究。
  喹诺酮是一种人工合成抗生素,具有抗菌谱广,副作用小等优点,目前己被广泛使用,这也造成了细菌对其耐药率的提高。
  本研究从济南小清河、污水处理厂以及医院周边采集水样,共筛选出215株不同的喹诺酮耐药细菌,并检测了细菌质粒介导的三种喹诺酮抗性基因发现qnr基因为阳性的共有15株,其中包括含有qnr A的1株含qnrB的10株,含qnrS的4株;检出qepA为阳性的菌株共有91株,检出其变体aac(6')-Ib-cr阳性菌株30株。实验中还利用接合转移实验对qnr基因的可转移性进行了检测,发现共有4株细菌的qnr基因发生了接合转移,且均为qnrB基因。
  实验还对这215株细菌进行了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ整合子的检测检出含有Ⅰ型整合子的细菌158株,含有Ⅱ型整合子的1株,两者均含的4株,未发现含有Ⅲ型整合子的细菌。接下来对含有整合子的细菌进行基因盒的检测,共发现了13种不同的基因盒阵列,其中大小为1740bp的基因盒dfrA17-aadA5和大小为1989bp的基因盒dfrA12-orfF-aadA2出现的频数最大,出现次数分别为28和24次。Qnr基因有可能与整合子-基因盒系统相偶联发生转移,实验中检测了与这种偶联相关的基因orf513及接合子的整合子-基因盒系统。
  在琼脂纸片药敏试验中,发现细菌对早期抗生素如萘啶酸、氨苄西林等的耐药性已经达到了90%以上,耐药现状极其严重,这需要引起人们的足够重视。

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