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基于结构生物学的金属蛋白酶抑制剂类抗癌药物的发现与活性研究

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摘要

第一部分研究背景
　　 癌症(cancer)即恶性肿瘤(malignant tumor)，是机体正常细胞在多原因、多阶段与多次突变所引起的一大类疾病。癌细胞的生长和分裂速度高于正常细胞，生长失控，且会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部位。肿瘤的发生、发展过程极其复杂，多种金属蛋白酶(metalloproteinase)起到非常关键的作用，在肿瘤演进的各个环节，几乎都能检测到其高水平表达，特别是肿瘤的浸润与转移过程。
　　 金属蛋白酶是活性中心含有金属离子的蛋白酶的总称，肿瘤生物学研究表明，金属蛋白酶家族中的两类锌离子依赖性金属蛋白酶：组蛋白去乙酰化酶(HDACs)和氨肽酶N(APN/CD13)与肿瘤的发生发展过程关系密切。在肿瘤细胞中，HDACs的过度表达导致组蛋白与DNA结合力增强，从而引起染色体异构，影响基因转录。与此同时，过度表达的HDACs能抑制细胞周期抑制因子p21WAF1/CIP1的表达，降低肿瘤抑制因子p53的稳定性，并且促进肿瘤细胞中的缺氧诱导因子(HIF-1)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达。研究发现，HDACs抑制剂(HDACⅰ)，通过抑制HDACs的酶活性，能有效抑制肿瘤细胞增殖，导致细胞周期阻滞，并诱导细胞凋亡。因此，HDACs已经成为抗癌药物设计的新靶标，HDACⅰ也已成为治疗肿瘤的有效化疗药物。APN为锌离子依赖性的Ⅱ型膜结合金属蛋白酶，参与激活生物活性肽、降解细胞外基质、参与抗原递呈等多种生物学过程。研究发现APN在肿瘤细胞表面高度表达，在肿瘤细胞的侵袭与转移过程中发挥着重要作用。APN通过降解细胞外基质，促进多种生长因子的释放，加速肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞侵袭与转移。此外，APN刺激血管内皮细胞释放肿瘤微血管形成相关因子，促进肿瘤新生血管的形成。因此，APN抑制剂(APNⅰ)也有望发展成为一类新型的抗肿瘤药物。
　　 本研究拟以HDACs和APN/CD13为作用靶点，以结构生物学为手段，通过对肿瘤发生、发展和肿瘤新生血管生成具有重要影响的生物大分子HDACs和APN/CD13蛋白的克隆、表达与纯化，并进行单晶培养，获得其三维结构信息，从而为蛋白质功能研究及相关药物设计提供帮助。基于结构生物学的药物发现，也就是基于受体的药物发现，是指一般应用由X-射线衍射、核磁共振或分子模拟(同源蛋白建模法等)提供的受体三维结构信息，来辅助寻找、设计能够与它发生相互作用并调节其功能的小分子化合物的过程。一般来说，在通过X-单晶衍射技术或多维NMR获得靶点蛋白活性位点的结构后，就可以采用分子模拟软件分析结合部位的结构性质，特别是静电场、疏水场、氢键作用位点等分布信息，然后运用数据库搜寻或运用全新药物分子设计技术，识别得到分子形状和理化性质与受体作用位点相匹配的分子结构，合成并测试这些分子的生物活性。经过反复的药物设计、活性测试验证，有望发现新的先导化合物。
　　 第二部分人HDAC8和古菌属硫化叶菌APN的克隆、表达、纯化、蛋白晶体筛选及其生化性质研究
　　 基于结构生物学的药物发现，首先需要获得靶点蛋白，只有得到较纯的靶点蛋白，才能研究该靶点的生化性质及蛋白质三维结构等内容。本部分内容主要是克隆、表达并纯化获得所研究的靶点蛋白：人HDAC8和古菌属硫化叶菌APN，并进行蛋白结晶条件的筛选与优化，同时对其理化性质进行了初步研究。
　　 在HDACs家族中，锌离子依赖性的HDACs在调节基因转录与基因表达方面具有更加重要的作用。ClassⅠ家族包括HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8属于锌离子依赖性HDACs，在体内分布广泛，对HDAC底物表现出更好的去乙酰化酶的活性，且研究表明与肿瘤的发生发展关系密切，目前设计合成的许多HDACⅰ对ClassⅠ家族的各个成员都有良好的抑制活性。ClassⅠ家族在蛋白的一级序列上表现出很高的同源性。HDAC1和HDAC2是负责组蛋白结构修饰的两个重要的亚型。HDAC1、HDAC2和HDAC3在体内需要与其它蛋白结合形成复合物来发挥生理活性，而HDAC8以单体蛋白的形式存在，因此采用基因重组，克隆表达出的HDAC1、HDAC2和HDAC3的单个蛋白往往没有酶活性，而HDAC8结构相对简单，且以单体形式发挥作用，因此以HDAC8为先导靶点，设计合成HDACⅰ更具有可行性。目前，已有报道HDAC8的三维晶体结构，及其与抑制剂SAHA和TSA的晶体复合物的三维晶体结构，这为我们设计合成HDACⅰ提供了帮助。应本实验室设计合成化合物活性筛选的要求，本研究成功构建了两种HDAC8的重组质粒：pGEX-6p-1-hHDAC8和pET21b-hHDAC8，并均能在大肠杆菌中表达，纯化获得电泳纯、并具有较高酶活性的HDAC8。同时我们采用气相扩散法搜索初步结晶条件，并对得到微晶的条件进行了优化，拟得到适合于X-射线衍射的单晶。与此同时，我们在结晶时加入一定浓度的底物或抑制剂以期得到复合物晶体。目前已有晶体长成，但所获得晶体仍未达到收集衍射数据的要求，仍然需要进一步优化。此外，生化研究发现，NO可以可逆的调节HDAC8的活性，且当HDAC8与NO供体共孵育，可诱导HDAC8发生S-亚硝基化修饰，这提示信号分子NO可能参与调节HDAC8的生物学功能。
　　 人APN是由967个氨基酸残基组成的糖蛋白，通常以二聚体的形式存在，由于人APN分子量大，结构复杂，且存在复杂的糖基化修饰，因此目前要获得纯的有活性的人APN蛋白十分困难。由于不同来源的氨肽酶N与活性中心Zn2+结合的氨基酸残基高度保守，因此通过寻找与人APN同源性相对较高的其他种属APN，来代替人APN研究APNⅰ成为可行的研究方案。本文通过序列比对，发现古菌(Archaeobacteria)属硫化叶菌(Sulfolobuss olfataricusP2)APN(NCBIaccession no.NP_344003)与人APN的同源性达到30％。古细菌作为现今最古老的生物群，是地球原始大气缺氧时代生存下来的活化石，其结构相对简单，且基因序列高度保守，因此以古细菌APN代替人APN来筛选APNⅰ具有一定的可行性。本研究成功克隆得到古菌属硫化叶菌APN，并构建重组表达质粒，表达纯化得到了电泳纯蛋白，并对该蛋白的理化性质进行了研究。通过研究发现古菌属硫化叶菌APN表现出良好的酶活性，已上市APN抑制剂Bestatin对古菌属硫化叶菌APN也表现出良好的抑制作用，因此古菌属硫化叶菌APN可以作为APNⅰ初步活性筛选用酶。此外，通过蛋白晶体培养，获得了晶型较好的蛋白晶体，可以通过进一步优化结晶条件以获得衍射数据，解析三维晶体结构，从而为APNⅰ的设计合成提供帮助。
　　 第三部分 HDAC8和APN抑制剂的筛选以及活性先导化合物的药效评价和机制研究
　　 该部分内容主要是对本实验室自行设计合成的肉桂酰胺类和四氢异喹啉类HDAC抑制剂，以及通过虚拟筛选获得的APN抑制剂类化合物进行了体内外生物活性评价和部分抗癌机制研究。
　　 针对HDACⅰ的筛选，本研究首先对化合物进行了抑酶活性评价，采用重组表达的HDAC8作为化合物的初步活性筛选的酶源，筛选获得具有一定抑酶活性的化合物。对筛选获得具有较高酶抑制活性的化合物，再采用商品化的HDAC活性检测试剂盒进行进一步的酶活性确证。对筛选获得具有很高酶抑制活性的化合物，再进行细胞水平上的活性评价。根据文献调研，选择了3～6种HDACs高表达的肿瘤细胞进行抗肿瘤细胞增殖的实验。细胞水平筛选获得的优势活性化合物进一步采用裸鼠移植瘤模型，进行动物体内活性评价，从而获得优势活性先导化合物。综合所有活性试验数据发现，肉桂酰胺类HDAC抑制剂5j显示出较好的抑瘤活性，具有一定的开发潜力。同时四氢异喹啉类HDAC抑制剂D08a也表现出很好的抗肿瘤活性，其酶抑制活性和抑制细胞增殖活性明显优于已上市的HDAC抑制剂SAHA，且通过动物实验发现其对多种肿瘤具有较好的抗肿瘤活性，特别是乳腺癌和结肠癌，具有很大的开发潜力，有望成为新的HDAC抑制剂类抗肿瘤药物。
　　 本部分内容对肉桂酰胺类HDAC抑制剂的5j进行了较为全面的药效学评价及抗肿瘤作用机制研究。结果表明5j能显著抑制HDAC1，HDAC8以及Hela细胞核提取物(主要含有HDAC1和HDAC2)的酶活性，且活性优于阳性药物SAHA。MTT试验结果表明，5j对多种肿瘤细胞均具有较好的抑制细胞增殖活性，其中对乳腺癌细胞株尤为敏感，因此我们把研究重点侧向于乳腺癌，选择了两种乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7作为进一步的活性及机制研究对象。根据HDACs的功能，首先检测了5j对组蛋白乙酰化水平的影响，结果发现5j能显著性提高细胞核中组蛋白4的乙酰化水平，且呈浓度依赖性。另外观察了5j对细胞周期、细胞凋亡的影响，发现5j主要诱导细胞阻滞于G2期，并能诱导细胞凋亡，且呈一定的浓度依赖性。根据5j对细胞周期、凋亡的影响，进一步采用Western blot法检测了5j对细胞周期及凋亡通路密切相关蛋白表达的影响。研究发现5j能浓度依赖性的显著诱导细胞周期抑制因子p21WAF1/CIP1的表达。另外，5j能抑制Bcl-2凋亡通路中的Bcl-xL表达，且Caspases通路的Caspase3表达也显著降低。由于Caspase3在体内需要被激活，分解成两个亚肽起作用，因此进一步检测了5j对Caspase3活性的影响，综合Caspase3酶原形式蛋白减少与活性增加，说明5j诱导细胞凋亡可能与Caspases细胞凋亡通路有关。此外，发现5j能显著抑制基质金属蛋白酶2(MMP2)的活化，由于MMP2在乳腺癌的侵袭与转移过程中具有十分重要的作用，因此进一步考察了5j对乳腺癌细胞迁移与细胞侵袭的影响，发现5j能显著减缓细胞迁移速度，并能抑制细胞侵袭。另外，还采用裸鼠移植瘤模型，将人乳腺癌细胞接种到裸鼠皮下，观察5j的抑瘤效果。结果发现5j能显著抑制肿瘤生长，且抑瘤活性显著高于阳性药SAHA。综合所有实验数据表明，5j具有开发成治疗乳腺癌的HDACⅰ类抗肿瘤药物的潜力。
　　 针对APNⅰ的筛选过程类似于HDACⅰ的筛选，评价从酶活性水平到细胞水平，再到动物水平。本研究以猪APN和硫化叶菌APN作为APNⅰ筛选用酶，进行酶活性筛选。对筛选获得的APNⅰ，再选择APN高表达的HL-60，ES-2细胞检测APN抑制剂的抗肿瘤细胞增殖活性，并以APN低表达的K562细胞作为对照。综合活性试验结果，研究发现虚拟筛选获得的化合物HW02能明显抑制猪氨肽酶N的活性，其抑制常数优于阳性药Bestatin。由于不同来源的APN存在结构差异，又设计了采用高表达APN的细胞株HL60和ES-2作为APN酶源，检测其抑制活性，发现HW02的抑酶活性明显优于阳性药Bestatin。MTT试验结果表明，HW02对多种肿瘤细胞株具有抑制增殖的作用，且主要阻滞细胞于G1期，并能诱导细胞凋亡。由于APN与肿瘤细胞的侵袭密切相关，因此我们还检测了HW02对细胞侵袭的影响，并发现HW02能显著抑制细胞侵袭。综上所述，HW02可能是一个潜在的具有一定抗肿瘤活性的APN抑制剂。
　　 第四部分结论
　　 本课题基于结构生物学的药物发现为指导思想，以两类金属蛋白酶-HDACs和APN为研究靶点，以本实验室设计合成的HDAC抑制剂与APN抑制剂为研究对象，通过构建靶点蛋白人HDAC8和古菌属硫化叶菌APN，从分子水平、细胞水平和动物水平上逐步进行活性评价，筛选发现了2个HDAC抑制剂及1个APN抑制剂，并对这几个化合物进行了药效评价与机制研究，发现这几个化合物具有一定的开发潜力。与此同时，还将筛选获得的抑制剂与靶点蛋白进行共结晶培养，以获得靶点蛋白与抑制剂相互作用的三维结构信息，从而为进一步结构优化提供有利的试验依据，并为发现活性更好的新型抗肿瘤药物打下坚实的基础。

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