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博德特氏菌产透明质酸初步研究

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第一章绪论

1.1在化妆品行业中的应用

1.1.1保湿作用

1.1.2营养作用

1.1.3修复作用

1.2在医学上的应用

1.2.1治疗关节炎

1.2.2在眼科中的应用研究

1.2.3作为辅助药物的用途

1.3生理功能

1.3.1参与多种基质的构成

1.3.2保水作用、渗透压及溶胀压

1.3.3分子排阻效应及扩散速率的影响

1.3.4润滑作用

1.3.5对细胞的保护作用

1.4透明质酸的生产方法

1.4.1传统生产方法

1.4.2现代生产方法

1.5本论文的目的及研究内容

第二章博德特氏菌产多糖的条件优化

2.1材料和方法

2.1.1菌株及培养条件

2.1.2常用储备液及缓冲液

2.1.3试剂及仪器

2.1.4实验方法

2.2结果与讨论

2.2.1多糖测定标准曲线的制作

2.2.2 Bordetella sp.B4菌的生长曲线

2.2.3碳源对多糖产生的影响

2.2.4胆固醇氧化酶的酶活对多糖产生的影响

2.2.5葡萄糖对多糖产生的影响

2.2.6单因子优化培养基

2.2.7正交试验优化产糖培养基

2.3小结和展望

第三章博德特氏菌产多糖的分离纯化和性质研究

3.1材料和方法

3.1.1菌株和培养基

3.1.2常见储备液及缓冲液

3.1.3试剂与仪器

3.1.4实验方法

3.2结果与讨论

3.2.1多糖的HPLC分析

3.2.2 DEAE阴离子交换层析

3.2.3 Sephadex G100纯化多糖

3.2.4多糖的红外分析

3.3小结和展望

总结

参考文献

致 谢

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摘要

透明质酸(hyaluronic acid,HA)是一种广泛分布于人和动物体内的大分子酸性黏多糖。自20世纪30年代Mayer首次从动物眼玻璃体中提取得到HA后,HA的生产和应用研究至今已有70余年的历史。HA有独特的黏弹性和生理功能,是细胞外基质的主要成分,具有保水、润滑、调节渗透压等作用,可保护正常细胞免受毒性细胞、自由基等的侵袭,并可影响细胞增生、分化等。因此,HA被广泛用于骨科、眼科、妇科、外科手术后防粘连、整形美容及保健食品等领域。传统上生产多糖都是从动物组织中提取,但是后来人们也开始利用微生物发酵生产多糖。主要以兽疫链球菌(Streptoccus zooepidemicus)和多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)变异株为主。发酵法生产HA是HA工业的一场革命。生产出的HA成本大大降低,质量得到前所未有的提高,分子量大于动物组织提取所得HA,产品不受原料资源的限制,工艺也较简单。但这2种菌是动物性致病菌,用以工业生产始终有一定得危险性。 博德特氏菌是一株以胆固醇为唯一碳源,合成生产胆固醇氧化酶和雄性激素的革兰氏阴性细菌,由本实验室从济南市郊区土壤中筛选获得。在分离纯化胆固醇氧化酶的时候,发现该菌能够生产酸性粘多糖。由于酸性粘多糖的产生和培养基中胆固醇的添加有关,于是从博德特氏菌的产酶培养基出发,优化产糖培养基,提高了多糖的产量。使其发酵生产多糖的量稳定在8g/L左右,超过传统的兽疫链球菌和多杀性巴氏杆菌。随后我们使用DEAE阴离子交换柱和G100分子筛分离纯化多糖,并且利用红外、高效液相色谱对此多糖结构进行分析,结果表明该酸性多糖和透明质酸的的性质极为相似。本文的创新点在于这是世界上首次发现多糖的产生和胆固醇的利用相关,并且博德特氏菌也是一个新的产多糖的革兰氏阴性菌,其多糖产量达到了8g/L,超过文献报道的其它多糖产生菌。在一次发酵培养中,博德特氏菌能够生产胆固醇氧化酶、雄性激素和多糖3种有价值的产物,并且这种细菌对人和动物没有危害,可以大规模的应用于工业生产中。

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