特异性启动子控制双自杀基因系统靶向治疗多药耐药胶质瘤的研究

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第一部分脑胶质瘤多药耐药细胞系C6/ADR的建立及鉴定目的：采用逐渐增加培养基中药物浓度的方法联合短期暴露于高浓度的抗癌药物的方法，在体外建立脑胶质瘤C6耐阿霉素细胞株MDR细胞系，观察C6及C6/ADR细胞的形态学改变，并对其多药耐药特性进行鉴定，为下一步的实验打下基础。研究方法：（1）取对数生长期C6细胞在37℃，5％CO2全湿度培养箱内培养于低浓度的阿霉素，每种药物浓度维持四周后，然后暴露在高药物浓度中进行培养36小时，利用MTT法，计算不同药物对C6细胞的抑制率，来确定阿霉素药物终浓度为1μg/ml。（2）用光学显微镜及电子显微镜观察活细胞的形态结构及生长特点或经HE染色后观察。（3）利用MTT法，以540nm为测试波长，630nm为参考波长的酶标仪上读取C6及C6/ADR细胞的光密度值，以OD值代表细胞数为纵坐标，以时间为横坐标，绘制生长曲线，来观察细胞增殖情况，并计算细胞倍增时间。并利用克隆形成试验测定C6及C6/ADR单个细胞增殖能力，将培养板倒置并叠加一张带网络的透明胶片，在显微镜下计数大于50个细胞的克隆数，来计算克隆形成率。（4）RT-PCR法来检测C6及C6/ADR细胞MDR1基因mRNA水平变化：用UNIQ-10柱离心式Trizol总RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA，利用非特异性引物进行逆转录反应，然后用MDR1检测引物进行PCR扩增，取PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶中电泳30 min，紫外透射分析仪下观察结果并拍照。同时，用Western blot法分析C6及C6/ADR细胞中MDR1蛋白的表达情况。利用流式细胞免疫学方法对多药耐药基因MDR1编码蛋白P-gp的进行定量研究。（5）收集并整理实验数据，进行统计学分析，P<0.05有统计学差异。结论：（1）C6及C6/ADR细胞在光镜下两者差别不大，但透射电镜发现C6/ADR细胞和C6细胞的超微结构明显不同，特别是内质网及线粒体丰富，这提示随着耐药性的增加，酶类的合成也在增加，进一步提示了耐药的复杂性。（2）C6/ADR细胞产生耐药后，其细胞倍增时间以及单个细胞的克隆能力与C6细胞没有太大差异，这说明C6/ADR细胞的增殖能力以及单个细胞的克隆能力并没有受到明显的影响。（3）多药耐药蛋白基因能够在C6/ADR细胞中能够高表达P-gp，而在C6细胞中基本不表达。第二部分 MDR1启动子控制双自杀基因系统的建立及其在耐药胶质瘤细胞中特异性表达的研究目的：从耐药胶质瘤C6/ADR细胞中克隆多药耐药基因启动子，构建MDR1P控制的双自杀基因表达载体，并初步研究其在C6/ADR中的表达情况。研究方法：（1）提取C6/ADR基因组DNA，PCR扩增MDR1P，克隆入T载体，NdeⅠ和HindⅢ双酶切MDR1P，获得相应粘性末端的MDR1P片段，纯化并进行加A反应，将其连接入通用载体pMD18Simple-T中，形成MDR1P-T载体，转化JM109感受态菌后小量提取质粒，PCR及测序鉴定。（2）NdeⅠ/HindⅢ双酶切pcDNA3-TK质粒和MDR1P-T载体，利用T4 DNA连接酶用MDR1P置换pcDNA3-TK中的CMV启动子，获得pcDNA3-MDR1P-TK，进行PCR及测序鉴定。（3）利用BamHⅠ酶切pcDNA3-MDR1P-TK及pcDNA3-CD-TK，将pcDNA3-CD-TK中的CD基因插入到pcDNA3-MDR1P-TK中TK基因的上游，从而获得pcDNA3-MDR1P-CD-TK，进行PCR及测序鉴定。（4）在脂质体介导下将pcDNA3-MDR1P-CD-TK转染C6和C6/ADR细胞，G418筛选获得稳定转染细胞株，用PCR鉴定自杀基因在两种细胞中的整合情况，RT-PCR鉴定CD、TK在在两种转染细胞中的表达情况。结果：（1）从C6/ADR基因组DNA中提取的MDR1P片段，PCR成功扩增出260bp的MDR1P并克隆入T载体后，PCR产物测序结果，与基因bank的序列一致。（2）经分子克隆技术将MDR1P成功插入pcDNA3-TK质粒中，形成pcDNA3-MDR1P-TK，PCR扩增可见1600bp大小的阳性条带。（3）经过BamHⅠ酶切质粒pcDNA3-CD-TK后获得CD基因，通过基因重组技术成功将其插入同样酶切后的pcDNA3-MDR1P-TK质粒TK基因的上游，形成pcDNA3-MDR1P-CD-TK；PCR结果显示1～4均为阳性克隆，初步表明重组正确。（4）脂质体法将质粒pcDNA3-MDR1P-CD-TK成功稳定转染入C6和C6/ADR细胞，命名为C6/CDTK、C6/ADR/CDTK，其形态与C6、C6/ADR细胞无差异。结论：（1）成功建立了MDR1启动子调控的CD-TK双自杀融合基因表达系统。（2）将质粒pcDNA3-MDR1P-CD-TK成功稳定转染入C6和C6/ADR细胞，获得稳定的C6/CDTK、C6/ADR/CDTK转染细胞。（3）证实MDR1启动子调控的CD-TK双自杀融合基因表达系统能够在耐药胶质瘤细胞可特异性表达，而在C6/CDTK细胞中不表达。第三部分 MDR1启动子靶向的双自杀基因/前体药物治疗多药耐药胶质瘤的研究目的：研究多药耐药基因启动子靶向控制的CD-TK双自杀基因系统并加前体药物丙氧鸟苷及5-氟胞嘧啶（pcDNA3-MDR1P-CD-TK/GCV+5-FC）对MDR1高表达的耐药胶质瘤细胞的体外特异性杀伤作用。研究方法：（1）将双自杀基因转染的C6细胞、C6/ADR细胞各分两组，分别接种于6孔培养板中，加入含或不含GCV60μg/ml、5-FC600μg/ml的RPMI-1640培养液。培养24 h后，在倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况。（2）取对数生长期的C6、C6/ADR、C6/CDTK、C6/ADR/CDTK细胞，加入不同浓度的前体药物GCV和/或5-FC，对照组不加前体药物，利用MTT法，以540nm为测试波长，630nm为参考波长的酶标仪上读取用C6及C6/ADR细胞的光密度值，以细胞生存率为纵坐标，以前体药物浓度为横坐标，绘制细胞存活曲线，来观察细胞存活情况。（3）取对数生长期的C6、C6/ADR、C6/CDTK、C6/ADR/CDTK细胞，加入含或不含GCV60μg/ml、5-FC600μg/ml的RPMI-1640培养液，利用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡，利用TUNNEL，法用显微镜来观察细胞的死亡情况。（4）取3×104/ml的C6、C6/ADR、C6/CDTK、C6/ADR/CDTK细胞，加入含或不含GCV60μg/ml、5-FC600μg/ml的RPMI-1640培养液，将培养板倒置并叠加一张带网络的透明胶片，在显微镜下计数大于50个细胞的克隆数，来计算克隆形成率。（5）收集并整理实验数据，进行统计学分析，P<0.05有统计学差异。结果：（1）未转染自杀基因的C6、C6/ADR细胞，应用前体药物后，生长状态良好，细胞数量和细胞增殖无明显变化；且GCV和5-FC联合用药较二者单独用药也无明显差异；而C6/ADR/CDTK细胞用药后内颗粒逐渐增多，细胞变得越来越皱缩，贴壁性能减弱，生长状态变差，细胞数量变少，且联合用药更加明显。（2）MTT结果显示C6/CDTK细胞的存活率比C6细胞下降稍明显一些，随着药物浓度的增大细胞存活率有轻微的下降情况，C6/ADR细胞存活率与C6细胞相似，细胞存活率变化不大，而C6/ADR/CDTK细胞增殖明显受抑，细胞存活率明显下降，且有明显的剂量依赖关系。（3）流式细胞仪检测结果显示加入前体药物后与C6/CDTK细胞相比，C6/ADR/CDTK细胞的细胞凋亡率明显提高，而且联合用药比单一用药效果更显著，凋亡率达到22.64％；另外，C6/ADR/CDTK细胞的细胞周期绝大部分被阻滞在G1期，且几无DNA合成。利用TUNNEL法来检测C6细胞、C6/ADR细胞、C6/CDTK细胞结果为阴性，C6/ADR/CDTK细胞结果为阳性。（4）细胞克隆形成实验结果显示C6细胞、C6/ADR细胞、C6/CDTK细胞的克隆形成率均在90％以上，而C6/ADR/CDTK细胞的克隆形成率明显降低，两种药物联合应用，克隆形成率降低更为明显，只有16.71±0.31％。结论：本研究为解决胶质瘤等恶性疾病产生对化疗药物的耐药问题提供了一条新的治疗思路和途径。

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作者
张源;
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作者单位

山东大学;

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授予单位山东大学;
学科神经外科
授予学位博士
导师姓名朱树干,王成伟;
年度 2009
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类神经组织瘤;化学（药物）疗法;
关键词
多药耐药; 胶质瘤; 前体药物; 自杀基因; 基因启动子; 细胞免疫学;

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