Survivin启动子控制的自杀基因HSVtk真核表达载体

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种由Survivin启动子控制的自杀基因HSVtk真核表达载体，所述真核表达载体对KYSE150食管癌细胞具有特异性杀伤作用。

背景技术

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，这种肿瘤的发生与地区、种族和病理类型差异有关。全世界每年约有20万人死于食管癌，我国是食管癌的高发国家，在肿瘤死亡率中仅次于胃癌，发病年龄多在40～60岁，男性多于女性。目前的食管癌治疗策略包括手术和放疗、化疗，手术为最主要的治疗手段。但由于多数患者发现时已为晚期，传统治疗方法对再发和转移的晚期肿瘤治疗效果不理想，且会对患者造成较大的毒副作用。因此，肿瘤的基因治疗成为一种有前景的治疗策略。

基因治疗是将外源基因转导到靶细胞中，对疾病相关基因缺陷和异常进行相应的修正或补偿，以达到最终治疗效果。肿瘤基因治疗研究中常被关注的是单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷 (HSVtk/GCV)自杀基因系统。HSVtk/GCV治疗肿瘤的机制主要包括自杀效应和旁观者效应。自杀效应指HSVtk基因可编码胸苷激酶，而胸苷激酶又可以磷酸化多种核苷酸类似物，例如抗病毒药物更昔洛韦(GCV)。在DNA的复制过程中，磷酸化的GCV可以终止DNA链3'-OH端碱基的延长，从而终止DNA的复制过程，导致细胞凋亡。旁观者效应即自杀基因转染到部分肿瘤细胞中，当加入GCV时，肿瘤细胞明显被杀伤，而周围未转染目的基因的细胞也被大量杀死。因此，HSVtk/GCV自杀基因体系已经成为恶性肿瘤基因治疗的有效手段之一。

基因治疗是否有效，取决于被转染到靶细胞中的外源基因能否稳定表达，而这需要构建一种安全性较高的载体。因此，需要选择一种理想的特异性启动子连接到载体中，以限制治疗基因的无选择表达。目前的研究表明，一些启动子已经被成功运用到肿瘤基因治疗中，对肿瘤细胞的生长起到了明显的抑制作用，这为肿瘤的基因治疗创造了特异性的新靶点。

Survivin基因是凋亡抑制家族(IAP)中凋亡抑制作用最强的蛋白之一，该基因能够编码142个氨基酸，过表达于多种肿瘤细胞中，但在正常人组织细胞中几乎不表达。研究表明，Survivin基因与肿瘤的发生发展关系密切，它能够抑制细胞凋亡，使G2/M期细胞减少，促进细胞有丝分裂。

发明内容

本发明的目的是提供一种由Survivin启动子控制的自杀基因HSVtk真核表达载体，以调控所述自杀基因HSVtk对KYSE150食管癌细胞的特异性杀伤作用。

本发明所述的Survivin启动子控制的自杀基因HSVtk真核表达载体中含有SEQNO.1所示核苷酸序列的自杀基因HSVtk基因片段、SEQ>HSVtk基因片段被连接在质粒载体pBI-CMV₂上。

进一步地，本发明所构建的真核表达载体为pBI-CMV₂-AcGFP₁-pSurvivin-TK，在所述真核表达载体的Amp和Ori之间依次连接有GFP、CMV增强子、Survivin启动子和HSVtk基因片段。

本发明意外发现，Survivin启动子能够特异性调控HSVtk自杀基因对食管癌细胞的凋亡作用，即其能够特异性选择肿瘤细胞，从而提高自杀基因的靶向性。

据此，本发明成功构建了一种由Survivin启动子驱动的调控HSVtk自杀基因的真核表达载体pBI-CMV₂-AcGFP₁-pSurvivin-TK，并将其导入KYSE150食管癌细胞中，实验证明能够实现该载体在KYSE150食管癌细胞中的高效特异性表达。

本发明所构建的真核表达载体结合自杀基因系统能够有效抑制KYSE150食管癌细胞的生长增殖，表现出对KYSE150食管癌细胞的较高特异性及选择性，并具有较好的选择性及低毒性。至关重要的是，这种凋亡抑制作用比在HepG₂肝癌细胞中更加显著。

基于上述实验效果，本发明还涉及所述真核表达载体在制备治疗食管癌的药物中的应用。

将本发明构建的由Survivin启动子介导的真核表达载体转染到KYSE150食管癌细胞中，该启动子在KYSE150食管癌细胞中被活化，从而启动目的基因的表达，而在正常细胞中Survivin启动子无法被激活，目的基因不表达。因此，通过这个原理可将肿瘤细胞有效杀死。

附图说明

图1是本发明构建的pBI-CMV₂-AcGFP₁-pSurvivin-TK真核表达载体的质粒图谱。

图2是pBI-CMV₂-AcGFP₁-pSurvivin-TK真核表达载体中HSVtk基因的酶切鉴定电泳图。

图3是流式细胞仪检测的真核表达载体在KYSE150食管癌细胞和HepG₂肝癌细胞中的转染效率。

图4是Western blotting法检测真核表达载体在KYSE150食管癌细胞和HepG₂肝癌细胞中的蛋白表达情况。

图5是MTT法检测KYSE150食管癌细胞和HepG₂肝癌细胞的存活率。

图6是流式细胞仪检测KYSE150食管癌细胞和HepG₂肝癌细胞的凋亡情况。

图7是流式细胞仪检测线粒体膜电位的下降情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明技术方案进行进一步的说明。本发明所述实施例仅用于解释本发明，而不应理解为对本发明范围的限制。在不背离本发明技术方案的前提下，对本发明所作出的本领域技术人员容易实现的任何改动，都应认为是本发明的内容。

本发明所述实施例中的主要试剂和材料如下所述，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

人食管麟癌细胞系KYSE150，购自中国医学科学院肿瘤细胞库；人肝癌细胞株HepG₂，购自中科院上海细胞库；大肠杆菌DH5α，购自北京康为公司；各种限制性内切酶，购自Takara公司；质粒抽提纯化试剂盒，购自OMEGA公司；快速DNA提取扩增试剂盒，购自北京康为公司；所有引物购自上海生工生物工程公司；蛋白质提取试剂盒、蛋白质定量试剂盒，购自北京康为公司；羊抗的胸苷激酶单克隆抗体HSV-1，购自Santa>

实施例1：pBI-CMV₂-AcGFP₁-pSurvivin-TK真核表达载体的构建。

1、提取HepG₂肝癌细胞的基因组DNA。

培养HepG₂细胞，待细胞生长密度达80%时，收集细胞，PBS缓冲液洗两遍，以DNA提取扩增试剂盒提取基因组DNA，加入200μl>

2、PCR扩增Survivin启动子序列。

反应体系：2×PCR Master Mix，10μl；上游引物与下游引物各1μl；基因组DNA 2μl；RNase-Free Water 6μl。反应条件：95℃预变性3min，94℃变性40s，65℃退火30s，72℃延伸40s，共30个循环，最后72℃终延伸3min。

其中上游引物序列：5'-GCCATTAATCTGGCCATAGAACCAGAGAAGTGA-3’(SEQ NO.5)，下游引物序列：5'-ATACGCTAGCCGCACGCCCTCTTAGGCGGTCCACC-3’ (SEQ NO.6)。

扩增结束后，将PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳30min，成像。紫外仪下按照OMEGA公司购得的DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化PCR产物，洗脱出DNA，即Survivin启动子序列。

3、真核表达载体pBI-CMV₂-AcGFP₁-pSurvivin-TK的构建。

真核表达载体pBI-CMV₂-AcGFP₁-pSurvivin-TK的设计由本实验室完成，在质粒pBI-CMV₂的基本结构基础上构建所述真核表达载体，保留原有结构中的CMV增强子，并以凋亡抑制蛋白启动子(Survivin启动子)代替原有的巨细胞病毒启动子(CMV启动子)。

取由普如汀生物技术有限公司构建的质粒载体pAFP-TK-IRES2-EGFP，以SEQ NO.3所示的上游引物5'-CGCGGATCCATGGCTTCGTACCCCTGC-3'和SEQ NO.4所示的下游引物5'-CCCAAGCTTTCAGTTAGCCTCCCCCATC-3'进行扩增，得到HSVtk基因。取质粒载体pBI-CMV₂，用BamHI和HindIII双酶切后，以T4DNA连接酶与上述扩增得到的HSVtk基因连接，构建成含目的基因的质粒载体。

进一步将上述构建成功的质粒载体与扩增得到的Survivin启动子分别用XhoI和BamHI双酶切后，用T4DNA连接酶相连，构建成图1所示的在食管癌细胞中特异性高表达的真核表达载体pBI-CMV₂-AcGFP₁-pSurvivin-TK。

4、菌体转化。

离心管中加入DH5α感受态细胞100μl，置于冰浴中，待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入1ng构建的真核表达载体pBI-CMV₂-AcGFP₁-pSurvivin-TK，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min；42℃热击90s，迅速转移至冰浴中静置3min。向每个离心管中加入900μl不含抗生素的无菌LB培养基，混匀后置于37℃摇床，150rpm振荡培养45min，使菌体复苏。取100μl已转化的感受态细胞，加到含氨苄青霉素的LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，直至干燥，倒置平板，37℃培养12～16h，随后挑取单克隆菌落加入到LB培养基中继续培养，37℃、220rpm孵育4h。

5、质粒提取。

质粒提取采用OMEGA公司的质粒快速提取试剂盒。

收集细菌于1.5ml离心管中，加入250μl Solution I/RNaseA混和液，漩涡振荡；加入250μl Solution II，温和颠倒6次；加入350μl Solution III，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀，12000×g离心10min；转移上清液至套有2ml收集管的HiBind DNA结合柱中，10000×g离心1min，弃去收集管滤液；装回收集管，加入500μl HB Buffer，10000×g离心1min，弃滤液；重新装回收集管，加入700μl DNA Wash Buffer，10000×g离心1min，弃滤液；重新装回收集管，10000×g离心空柱2min以甩干柱子基质；把柱子装在干净的1.5ml离心管上，加入40μl Elution Buffer，静置2min，10000×g离心1min，洗脱出质粒DNA，即为pBI-CMV₂-AcGFP₁-pSurvivin-TK。通过酶标仪测定质粒DNA的浓度。

6、pBI-CMV₂-AcGFP₁-pSurvivin-TK的酶切鉴定。

在真核表达载体pBI-CMV₂-AcGFP₁-pSurvivin-TK的多克隆位点(MCS)中，BamHI与HindIII酶切位点之间存在着HSVtk基因，经双酶切后，通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，如若插入正确，将能被核酸内切酶切出一条1131bp的DNA条带。

酶切反应体系：真核表达载体pBI-CMV₂-AcGFP₁-pSurvivin-TK，1μg；BamHI，2μl；HindIII，2μl；10×K>

电泳结果如图2所示，证明HSVtk基因被成功插入，pBI-CMV₂-AcGFP₁-pSurvivin-TK真核表达载体构建成功。图中：Marker：D2000>/HindIII双酶切验证。

实施例2：真核表达载体在KYSE150食管癌细胞和HepG₂肝癌细胞中的转染效率。

通过脂质体Lipofectamine>TM介导，将pBI-CMV₂-AcGFP₁-pSurvivin-TK真核表达载体转染到KYSE150食管癌细胞和HepG₂肝癌细胞中，转染48h，消化、收集细胞，以PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测表达EGFP的细胞，计算表达EGFP细胞的百分比。通过各组细胞表达EGFP的百分比确定真核表达载体对两种细胞的转染效率（转染率=绿色荧光细胞数/细胞总数×100%）。

图3给出了流式细胞仪检测真核表达载体在KYSE150食管癌细胞和HepG₂肝癌细胞中的转染效率结果。图中：A为KYSE150食管癌细胞不转染真核表达载体的绿色荧光蛋白检测结果；B为KYSE150食管癌细胞转染真核表达载体48h后检测的绿色荧光蛋白结果，间接表示细胞转染率；C为HepG₂肝癌细胞不转染真核表达载体的绿色荧光蛋白检测结果；D为HepG₂肝癌细胞转染真核表达载体48h后检测的绿色荧光蛋白结果；柱状图表示四组细胞转染率的变化。

由图3结果可知，真核表达载体pBI-CMV2-AcGFP1-pSurvivin-TK被转染到KYSE150细胞和HepG₂细胞后，KYSE150细胞和HepG₂细胞的转染率均较高，两组转染率差异无统计学意义（P＞0.05）。

以下实施例在转染率一致的基础上，进一步检测自杀基因系统对食管癌和肝癌两种细胞的凋亡影响。

实施例3：Western blot法检测HSVtk自杀基因的蛋白表达。

将KYSE150食管癌细胞和HepG₂肝癌细胞分别接种于6孔板中培养。待细胞长至70～80%汇合时，参照Lipofectamine>TM说明书进行转染。更换六孔板细胞的旧培养基为无血清培养基，将脂质体和质粒复合物均匀加入相应孔中，6h后换液为含10%血清的培养基继续培养。转染48h后，弃去细胞培养基，用PBS洗两遍，每孔加入150μl>

配制工作液为A∶B=50∶1，充分混匀；用0.9%NaCl溶液将蛋白标准品稀释成2000μg/ml储存液，然后稀释至0～2000μg/ml；将25μl标准品和合适浓度范围的样本添加于96孔板的微孔中，各孔中加入200μl BCA工作液，充分混匀；盖上96孔板盖，37℃孵育30min。用酶标仪测定吸光度值(OD值562nm)，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

安装电泳仪并配胶，上样后开始电泳(电压100V)，完毕后切下合适尺寸的含目的条带凝胶，裁剪与胶大小一致的PVDF膜和6张滤纸一起放入转膜缓冲液中，再摆放于转膜仪转膜，结束后将膜置于5%脱脂奶粉中封闭1h，之后孵育一抗，即羊抗胸苷激酶单克隆抗体HSV-1稀释液(1∶800)4℃孵育过夜，次日，TBST洗三次，5min/次，再于二抗辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG(1∶10000)稀释液中孵育1h，TBST洗三次，5min/次，凝胶成像仪曝光分析结果。

结果如图4所示，图中泳道1为HepG₂肝癌细胞；泳道2为KYSE150食管癌细胞；泳道3为转染真核表达载体的HepG₂肝癌细胞；泳道4为转染真核表达载体的KYSE150食管癌细胞。实验结果表明，转染pBI-CMV₂-AcGFP₁-pSurvivin-TK真核表达载体的KYSE150食管癌细胞中HSVtk基因的蛋白表达量高，相对分子量约为36kD，在HepG₂细胞中HSVtk基因呈现弱表达，而在空对照组中未见明显表达。

实施例4：MTT法检测细胞毒性作用。

以pBI-CMV₂-AcGFP₁-pSurvivin-TK真核表达载体分别转染对数期生长的KYSE150食管癌细胞和HepG₂肝癌细胞，并设置未转染的KYSE150细胞和HepG₂细胞作为阴性对照，培养48h。消化收集细胞沉淀，细胞计数并用新鲜培养基稀释，将细胞按5000/孔接种于96孔板中，每孔培养液体积100μl，边缘孔用PBS缓冲液填充，置于CO₂培养箱中培养。接种24h后，按照剂量梯度为0、1、5、10、20、40、60、80μg加入GCV，每个剂量设5个复孔，置于CO₂培养箱中继续培养。三天后，向待测孔加入20μl>

结果如图5所示，KYSE150食管癌细胞转染真核表达载体48h后加入不同浓度的GCV可见，GCV对转染后的KYSE150细胞和HepG₂细胞均有显著抑制作用，且随着药物浓度的增高，转染后细胞的存活率也呈现出显著的下降趋势，而对于不转染任何真核表达载体的KYSE150细胞和HepG₂细胞未见明显抑制。并且结果还显示，真核表达载体对KYSE150细胞的毒性作用明显强于HepG₂细胞。

实施例5：流式细胞术检测HSVtk/GCV自杀基因系统对细胞凋亡率的影响。

将pBI-CMV₂-AcGFP₁-pSurvivin-TK真核表达载体转染到KYSE150食管癌细胞和HepG₂肝癌细胞中，并培养未转染真核表达载体的KYSE150细胞和HepG₂细胞作为对照，继续培养48h后，用不含EDTA的胰酶将细胞消化成单细胞悬液，1000rpm离心3min，收集各组细胞约1×10⁶个，弃上清，PBS洗两次后，加入Binding>

结果如图6所示，图中A代表KYSE150食管癌细胞不转染真核表达载体，也不加药物GCV处理，24h后流式细胞仪分析细胞凋亡率；B代表KYSE150食管癌细胞转染真核表达载体后，用前体药物GCV作用24h，流式细胞仪检测细胞凋亡率；C代表HepG₂肝癌细胞不转染真核表达载体，也不用GCV处理，24h后流式细胞仪分析细胞凋亡率；D代表HepG₂肝癌细胞转染真核表达载体后，通过GCV处理24h，流式细胞仪检测细胞凋亡率。柱状图表示四组细胞凋亡率的变化（n=3，*P＜0.05，**P＜0.01）。

右下象限为早期凋亡细胞，左上象限为总死亡细胞，早期凋亡率=右下象限细胞数/细胞总数，死亡率=左上象限细胞数/细胞总数。实验结果显示，相比于未转染真核表达载体的KYSE150细胞和HepG₂细胞，转染后的KYSE150细胞和HepG₂细胞凋亡率均显著提高，且KYSE150细胞的凋亡率高于HepG₂细胞，两者间变化具有统计学差异（P＜0.05）。

实施例6：流式细胞术检测HSVtk/GCV自杀基因系统对线粒体膜电位的影响。

以pBI-CMV₂-AcGFP₁-pSurvivin-TK真核表达载体转染KYSE150食管癌细胞和HepG₂肝癌细胞，并设置未转染的KYSE150细胞和HepG₂细胞作为阴性对照。加入前体药物GCV处理24h，消化收集各孔内细胞，分别重悬于0.5ml细胞培养液中；加入0.5ml>2培养箱中孵育20min；细胞孵育结束后，将细胞悬液转移至备好的1.5ml离心管中，1000rpm离心3～5min，沉淀细胞，弃上清；用(1×)JC-1染色缓冲液洗涤细胞两次；最后加入适量(1×)JC-1染色缓冲液重悬细胞；流式细胞仪可检测到红色荧光到绿色荧光的转变。

流式细胞仪检测结果如图7所示，图中A代表KYSE150食管癌细胞不做任何干预后检测红色荧光的数量；B代表KYSE150食管癌细胞转染真核表达载体后，前体药物GCV干预24h，检测红色荧光转变为绿色荧光的水平；C代表HepG₂肝癌细胞不转染真核表达载体，也不用GCV处理，24h后检测红色荧光转变为绿色荧光的水平；D代表HepG₂肝癌细胞转染真核表达载体后，通过GCV处理24h，检测红色荧光转变为绿色荧光的水平。通过比较能够显示出线粒体膜电位的下降情况。柱状图代表四组细胞线粒体膜电位下降百分比的变化（n=3，**P＜0.01，***P＜0.001）。

由图7可知，转染真核表达载体后的KYSE150食管癌细胞中红色荧光转变为绿色荧光的数量比转染真核表达载体的HepG₂细胞明显增加，表明线粒体膜电位下降，两组线粒体膜电位的变化具有统计学差异（P＜0.05）。而未转染组大多呈现红色荧光，细胞基本不死亡。