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比较基因组杂交在畸形胎儿非整倍体检测及产前诊断中的应用

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论文Ⅰ比较基因组杂交在畸形胎儿非整倍体检测中的应用

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材料与方法

结果

讨论

结论

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论文Ⅱ短串连重复序列和比较基因组杂交在唐氏综合征产前诊断中的应用

前言

材料与方法

结果

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结论

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攻读博士期间发表的论文

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摘要

第一部分，研究背景：先天性畸形存在于接近100％的新生儿中，潜在致命的先天性畸形的发生率为2％-3％，是新生儿生后1年内死亡的主要原因。其发病的重要原因是染色体的不平衡。目前经典的细胞遗传学分析方法一染色体核型分析和荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization，FISH)在研究染色体畸变方面起了重要作用。这两种方法非常有效，但是也存在明显的局限性。细胞遗传学方法容易因为外部污染、培养失败或母体细胞的选择性生长导致误差。FISH技术应用的探针并不适用于所有染色体不平衡的产前筛查，只局限于染色体特定区域。1992年，Kallioniemi等创建比较基因组杂交(Comparative GetaomicHybridization，CGH)技术，其基本原理是采用等量的患者基因组DNA(标记为绿色)、正常基因组DNA(标记为红色)作为探针，并用Cot-1 DNA抑制分散重复序列，将三者混合后与正常人的中期染色体铺片进行杂交。根据两种DNA探针的荧光信号强度差异来判断待测基因组中DNA的增加或缺失区域。 目的：建立方便实用的CGH方法路线，对通过超声检查确诊畸形后引产的胎儿或畸形新生儿进行非整倍体筛查，以检验该方法的敏感性和可靠性，并应用于产前诊断，以提高围产儿优生率。 方法：研究组选取于2006年7月-2007年1月在山东省立医院妇产科引产的畸形胎儿5例，宫内死亡胎儿1例，出生后发现畸形新生儿3例。入选病例均在产前检查时经B超确诊畸形或出生时发现2种以上的畸形，涉及心血管系统、中枢神经系统、骨骼系统或泌尿生殖系统，留取5-10ml羊水或2-5ml防凝脐带血；对照组采用我院健康查体中心就诊的身体健康的男性及女性各1名，抽取清晨空腹肘静脉血2ml防凝。采用Tiangen公司的DNA抽提试剂盒提取基因组DNA，紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度，Vys i s缺口平移试剂盒标记待测DNA和对照DNA，每份样本均分别标记SpectrumGreen和SpectrumRed。反应条件为15℃作用0.5h-1h以获得最佳DNA片段(300-3000bp)。将等量的SpectrumGreen标记的待测DNA、SpectrumRed标记的正常对照：DNA与足量的人Cot-1 DNA混匀，醋酸钠乙醇沉淀DNA，CGH杂交缓冲液重悬制成混合探针，加至正常中期染色体玻片的杂交区域，73℃共变性，封片后放入密闭湿盒，37℃孵育箱中杂交48-72小时。在74℃预热的0.4XSSC/0.3％NP-40溶液中洗片3-6秒，晾干后放入室温的2XSSC/0.1％NP-40溶液中洗片1-3秒，DAPI II复染。使用配备有CCD照相机和DAPI、SpectrumGreen和SpectrumRecl滤光片的荧光显微镜进行中期染色体分裂相的选择、摄像。荧光互换CGH：将待测DNA和对照DNA的荧光颜色互换，即SpectrumRed标记待测DNA、SpectrumGreen标记正常对照DNA，二者混匀，其余实验步骤同上述。使用CGH软件进行图像分析，选择5-10个杂交信号光滑，背景较低，着丝粒、异染色质区域标记探针结合较少以及DAPI带型较好的中期染色体，根据绿红两种信号的比值，分析每一染色体上的荧光强度比(fluoresterme intensity ratio，FR)，即可制作CGH拷贝数核型模式图，以1.0表示平衡比例。过高或过低的FR阈值可能会导致假阴性或假阳性结果，因此我们将FR阈值定为1.25和0.75，三体或染色体片段的扩增定义为FR>1.25，1.5以上视为高水平扩增；单体或染色体片段的缺失定义为FR<0.75。 结果：9例畸形胎儿/新生儿均成功的利用CGH方法进行了分析。其中病例4、8、9检测出染色体的不平衡并通过荧光互换CGH得到了确认。病例4的基因组DNA标记为绿色时，CGH核型为Dup 21，但在荧光互换CGH中仅检测到了21q的扩增。由于Cot-1。DNA抑制了标记的DNA与着丝粒和异染色质区域的杂交且每个个体在此区域差异较大，以及端粒处的荧光强度会下降至与背景荧光相似，所以这些区域一般都不在CGH分析范围之内。因此病例4的CGH核型为Dup 21q；病例8的CGH核型为Del 2p24-pter，Dup 12p13并通过荧光互换CGH得到证实；病例9在排除了22p异染色质区域的杂交偏移后，其CGH核型为Del 1p33-pter，Del 22q11-12。其余病例的检测结果未发现染色体缺失或扩增。 结论：荧光互换CGH能够减小在DNA标记和杂交过程中出现的偏移，在经典的细胞遗传学分析方法不可行时增加非整倍体病例检出的准确性和可靠性，可替代染色体显带技术用于非整倍体的筛查。 第二部分，研究背景：唐氏综合征又称21三体综合征或先天愚型，是由于21号染色体异常而表现为智力中重度低下、特殊面容及各种先天性畸形的综合征，群体发病率为1.23‰，占先天智力障碍的50％，在染色体畸变及与先天畸形有关的染色体疾病中位居首位。因患儿的出生给家庭和社会带来众多不良影响，且目前尚无有效治疗方法，因此只有进行早期诊断，终止妊娠，降低患儿的出生率，才能达到优生的目的。唐氏综合征的产前筛查包括孕妇血清标志物的筛查和超声检查。多项血清标记物联合应用筛查唐氏综合征，结合孕妇的年龄、孕周、体重及超声监测，通过相应软件进行计算，得到胎儿唐氏综合征的发病风险系数，对高危孕妇行羊膜腔穿刺取材、细胞遗传学方法进行产前诊断。羊水细胞培养和染色体G显带分析成功率高，是目前产前诊断的“金标准”。STR是目前应用最广泛的遗传标记，具有高度多态性和杂合性，联合应用PCR技术同时扩增21号染色体的多个STR标志，只要有一个标志出现三峰或三条带，即可做出唐氏综合征的诊断。STR-PCR方法敏感，所需DNA量少，可用妊娠早期乃至中、晚期羊水获取胎儿细胞DNA，实验周期短，操作简便，安全性高，还可做到几十个标本同时进行，为开展大规模的产前检测提供了技术保障。 目的：利用21号染色体上多个STR多态性分析快速检测胎儿是否唐氏综合征患儿，阳性病例采用比较基因组杂交检测，与传统的染色体核型分析结果进行比较，确认该方法的应用价值。 方法：选择2006年8月-2006年12月在山东省立医院和济南市妇幼保健院行唐氏综合征筛查结果为高风险的需进行羊膜腔穿刺的孕妇79例，胎儿畸形、死胎或新生儿畸形的孕妇9例作为研究对象。唐氏综合征筛查结果为高风险的孕妇：行羊膜腔穿刺抽取羊水28-30ml，25ml羊水离心后按常规实验室方法进行羊水细胞培养作染色体分析，剩余3-5ml羊水离心后留取沉淀；发现胎儿畸形、死胎的孕妇在行利凡诺羊膜腔内注射时留取羊水5-10ml，离心后留取沉淀；畸形新生儿产时留取脐带血2-5ml。采用Tiangen公司的DNA抽提试剂盒提取基因组DNA，紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。选择21号染色体的7个STR位点D21S1432、D21S1414、D21S1413、D21S1437、D21$2039、D21S11和D21S1446来检测胎儿是否罹患唐氏综合征；选择X和Y染色体所共有但长度序列有所不同的Amelogenin基因来确定胎儿性别。每份样本分8管进行，PCR反应条件如下：DNA反应体系20 μl，10×Buffer 2 μl、2.5 mM dNTP 1.6 μl、5 μM上下游引物各2 μl、HS-Taq酶0.1μl、DNA模板n μl(0.05 μg，根据基因组DNA浓度计算获得)、ddH<,2>O(12.3-n)μl。循环参数为：94℃预变性3 min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，5个循环；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃后延伸5 min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳确定PCR扩增效果，根据8号管PCR产物电泳结果确定胎儿性别。1-7号管的PCR产物用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测7个位STR点的带型，以确定是否为唐氏综合征患儿。经过21号染色体7个STR位点分析结果为21三体的样本，用比较基因组杂交方法进行核型分析，与细胞遗传学分析结果进行比较。 结果：3-5ml羊水中提取的DNA浓度为0.0386±0.0139μg/μl，最小值为0.0225μg/μl，提取的DNA最少为1.125 μg；9例畸形胎儿或新生儿的羊水或脐带血标本中提取的DNA总量是4-15.65μg，足够8管PCR反应及CGH实验所需。88例样本中男性39例，女性49例；检测出2例21三体，其中1饼(35号样本)来自唐氏综合征筛查高危的孕妇，7个STR位点中D21S1413、D21S2039表现为3条带，CGH核型为Dup 21，细胞遗传学分析结果为47，XY，+21；另1例(X4号样本)伴有胎儿心血管系统畸形和外观畸形，7个8TR位点中D21S1437、D21S2039、D21S11表现为3条带，CGH和荧光互换CGH证实其核型为Dup 21q，未进行细胞遗传学检查。 结论：利用STR-PCR结合聚丙烯酰胺凝胶电泳检测唐氏综合征，具有快速、经济、可靠的优点，在产前诊断领域有着广阔的应用前景。CGH在染色体非整倍体检测方面具有优越性。

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