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甲胎蛋白特异性转移因子诱导甲胎蛋白阳性肝癌细胞Bel7402凋亡的研究

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第一部分甲胎蛋白特异性转移因子(AFP-TF)的制备及其活性检测

实验材料与仪器设备

实验方法

实验结果

讨论

第二部分AFP-TF诱导AFP阳性肝癌细胞Bel7402和HepG2凋亡的研究

实验材料与仪器设备

实验方法

实验结果

讨论

第三部分AFP-TF诱导Bel7402细胞凋亡的信号通路研究

实验材料与仪器设备

实验方法

实验结果

讨论

第四部分AFP-TF诱导Bel7402细胞的凋亡与细胞内AFP的关系研究

实验材料与仪器设备

实验方法

实验结果

讨论

论文总结及展望

参考文献

致 谢

攻读博士学位期间发表的论文

发表论文一

发表论文二

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摘要

肝细胞癌(Hepatocellular carcmoma，HCC)是我国常见也是死亡率最高的恶性肿瘤之一。20世纪末期，虽然HCC的治疗已经取得了很大的进展，但传统治疗方法的效果仍然难以让人满意。近年来，以与HCC自身相关抗原为目标的免疫治疗或基因治疗的研究取得了很大的进展，甲胎蛋白(Alpha-fctoprotcin，AFP)就是其中的研究目标之一，AFP是胚胎时期由胎肝及卵黄囊产生的一类癌胚蛋白，在正常成人组织中含量极低，而当HCC发生时又会大量产生，已经被用作检测肝细胞癌变的重要标志。研究表明，一方面许多分泌AFP的肝癌细胞本身即有AFP的受体，分泌的AFP与AFP受体的结合对于维持HCC的生长有着重要的作用；另一方面AFP又能够抑制包括T细胞，B细胞，DC细胞及NK细胞在内的多种免疫细胞的免疫效应。因此，当HCC发生的时候，高表达的AFP不仅可以直接促进肿瘤细胞的生长，还可以使肿瘤细胞逃脱免疫系统的监视。 特异性转移因子(Transfer Factors，TF)是一类来源于致敏淋巴细胞的低分子量(≤6kDa)多核苷肽，它们携带有抗原激活的供体免疫细胞的免疫信息，能够特异性的将供体的免疫信息转移给免疫反应阴性的受体，并且诱导受体产生针对抗原的特异性免疫反应。此外，特异性TF还能够与致敏其产生的抗原特异性结合，并且这种特异性结合会导致其活性的消失。作为一种细胞免疫调节剂，特异性TF已经广泛的应用于临床治疗免疫缺陷、各种感染性疾病以及肿瘤等方面。 既然作为肝细胞癌标志物AFP本身对免疫系统具有抑制作用，而抗原特异性TF作为一种细胞免疫调节剂又能够诱导受体产生针对抗原的特异性免疫反应，据此，我们非常感兴趣利用AFP作为抗原制备的特异性TF(AFP-TF)有何活性作用。在本研究中，我们首次发现AFP-TF能够抑制AFP阳性肝癌细胞Be17402和HepG2的生长，诱导其发生凋亡，而对AFP阴性的肝癌细胞SK-Hep-1及正常肝细胞Changliver没有明显的作用。我们进一步阐明了在AFP-TF诱导AFP阳性肝癌细胞Be17402凋亡的途径以及在此凋亡过程中Be17402细胞自身分泌的AFP的参与作用。研究方法1、AFP-TF的制备及其活性检测1)参考kirkpatrick的方法，用AFP免疫成年猪，从致敏猪的脾脏中提取制备AFP-TF2)白细胞粘附抑制实验体外检测AFP-TF的活性3)小鼠足垫肿胀反应实验体内检测AFP-TF的活性4)AFP-TF与AFP的特异性结合实验2、AFP-TF诱导AFP阳性肝癌细胞Be17402和HepG2凋亡的研究1)MTT法检测细胞存活率2)倒置显微镜观察细胞的形态变化3)Giemsa染色检测细胞核的变化4)Hochcst 33258染色法检测细胞核的皱缩5)TUNEL法检测细胞中DNA的片断化6)流式细胞术分析细胞周期的变化7)透射电子显微镜(TEM)检测Be17402细胞内部结构的变化3、AFP-TF诱导Be17402细胞凋亡的信号通路研究1)Western blot检测细胞内凋亡相关蛋白的表达(Bcl-2、Bax、Cytochrome C)2)利用荧光探针Fluo-3 AM并结合荧光分光光度计检测细胞内Ca<'2+>浓度3)利用荧光探针Rh123并结合荧光分光光度计检测细胞内线粒体膜电位4)利用试剂盒(比色法)检测CaSpaLSe-9和Caspase-3的活性4、AFP-TF诱导Be17402细胞的凋亡与细胞内AFP的关系研究1)RT-PCR检测细胞内AFP mRNA的表达2)Western blot检测细胞内AFP的表达3)免疫细胞化学法检测细胞内AFP的分布及表达4)AFP表达载体的构建5)脂质体法转染AFP表达载体6)MTT法分别测定AFP-TF作用于预先在培养液中加入AFP的Bel7402细胞和转染AFP表达载体的Be17402细胞的存活率研究结果第一部分AFP-TF的活性检测体外活性检测表明制备的AFP-TF具有良好的白细胞粘附抑制活性，体内活性检测同样表明注射AFP-TF的小鼠在抗原AFP的诱导下足垫肿胀与对照相比具有显著性差异，并且在AFP-TF与AFP特异性结合后，AFP-TF的活性消失。 第二部分 细胞存活率检测AFP-TF对AFP阳性的肝癌细胞Bel7402和HepG2的生长有明显的抑制作用，而对于AFP阴性的肝癌细胞SK-Hep-1及正常肝细胞Changliver没有明显的抑制作用。 对照分析 AFP-TF与AFP特异性结合后，无AFP-TF活性的上清液对Be17402细胞没有明显的作用；AFP能够促进Bel7402细胞的增殖；AFP抗体对Bel7402细胞的生长有轻微的抑制作用；HBsAg-TF则对Bel7402细胞无明显的作用。 细胞凋亡检测 AFPTF作用于Bel7402和HepG2细胞后，光镜观察细胞呈现出凋亡的特有形态，细胞体积变小，发生皱缩，表面逐渐凸起小膜泡，并且可以见到凋亡小体的出现；Giemsa染色和Hochest 33258染色发现细胞核皱缩，染色质发生断裂： TUNEL法检测发现细胞核呈现深褐色(TUNEL阳性)，表明DNA发生片断化。而在AFP-TF作用后，SK-Hep-1和Changliver没有明显的凋亡特征。细胞周期分析在AFP-TF作用后，Be17402细胞中G<,0>/G<,1>期的细胞比例明显上升，G<,2>/M期的细胞比例略有上升，在HepG2细胞dpG<,0>/G<,1>期的细胞比例明显上升，而在SK-Hep-1和Changliver中细胞周期的变化不大。TEM观察在AFP-TF作用后，Be17402细胞核染色质固缩、边集到核膜周围，细胞表面微绒毛消失，胞质内细胞器结构不清，但是细胞轮廓保持完整。 第三部分 Western blot分析AFP-TF可以使Be17402细胞中Bc1-2的表达降低，Bax的表达升高，细胞质中的Cytochronle C表达升高而线粒体中的Cytochrome C表达降低。线粒体膜电位AFP-TF可使Be17402细胞线粒体膜电位在1 h内迅速下降，并且这种下降在12 h内呈现出时间依赖性，虽然在24 h有所上升，但仍然远低于正常细胞的线粒体膜电位。Ca<'2+>浓度AFP-TF 可使Be17402细胞内Ca<'2+>浓度在0.5 h内迅速上升，然后开始逐渐下降，并且这种下降在24 h内呈现出时间依赖性。Caspase-9和Dcaspase-3的活性AFP-TF可使Be17402细胞中Caspase-9和CaspaSe-3的活性明显高于未加AFP-TF的Be17402细胞。 第四部分RT-PCR分析AFP-TF对Be17402细胞中AFP-mRNA的表达无明显的影响。Western blot分析AFP-TF可使Be17402细胞中AFP的表达降低，并且呈现出剂量依赖性。免疫细胞化学在正常的Be17402细胞中，AFP在细胞膜和细胞质中呈现出明显的着色，并且着色边界清晰：而在经过AFP-TF处理的Be17402细胞中，AFP的着色浅且弥散，边界模糊。细胞存活率检测(在培养液中预先加入AFP和AFP转染Be17402细胞)与AFP-TF作用于正常的Be17402细胞相比，AFP-TF对预先在培养基中加入AFP的Be17402细胞和转染AFP表达载体的Be17402细胞的抑制作用降低。 研究结论 1、本研究首次发现AFP-TF能够特异性抑制AFP阳性肝癌细胞Be17402和HepG2的生长，但对AFP阴性的肝癌细胞SK-Hep-1及正常肝细胞Changliver没有明显的作用； 2、AFP-TF能够诱导AFP阳性肝癌细胞Be17402和HepG2发生凋亡； 3、AFP-TF使Be17402的细胞周期大部分阻滞在G<,0>/G<,1>期，小部分阻滞在G<,2>/M期，使HepG2的细胞周期阻滞在G<,0>/G<,1>期。 4、AFP-TF使Be17402细胞中线粒体膜电位迅速降低，Ca<'2+>浓度迅速上升，并降低了Bcl-2/Bax的比例，使Cytochrome C从线粒体释放到细胞质中，最终导致TCaspase-9和Caspase-3的激活。因而AFP-TF通过线粒体介导的凋亡途径诱导Be17402细胞凋亡。 5、AFP-TF能够在转录后水平下调Be17402细胞内AFP的表达，并且过量或过表达的AFP可以拮抗AFP-TF对Be17402细胞的抑制作用，这表明AFP-TF对Be17402细胞的生长抑制作用可能与Be17402细胞表达的AFP蛋白下调有关。 6、AFP-TF诱导AFP阳性肝癌细胞Bel7402发生凋亡可能是由于过量的AFP-TF与细胞内AFP的结合使AFP失去了原有的功能并逐步降解，而细胞内功能性AFP的减少又使其不能满足Bel7402细胞自身生长对功能性AFP的需要，最终导致了细胞凋亡的发生。

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