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回药扎里奴思方对脑缺血再灌注痰热腑实模型大鼠神经保护作用及炎性级联反应的影响

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前言

1.脑缺血的流行病学现状

2.脑组织缺血与相关炎症反应

3.脑缺血的中医研究和应用

实验一 痰热腑实证脑缺血大鼠神经功能及能量代谢的改变及扎里奴思方对其的影响

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5.结论

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5.结论

参考文献

第二部分 文献综述:病证结合脑梗死动物模型探讨

致谢

附录2：攻读学位期间发表的学术论文目录

附录3：个人简历

附录4：病理图片

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摘要

脑梗死造成的神经功能损害对人类的健康有着严重的影响，使患者出现残疾的几率已位居第一，病死率位居第三，仅低于癌症和心肌梗死。据世界卫生组织预计在每年大约有1500万患有脑血管相关疾病，缺血性脑血管病是其发病率的4/5。脑梗死的患病已经逐渐年轻化，其复发、致残和死亡的机率均较高，不但使患者的生活质量下降，也给家庭和社会造成了沉重的负担，给我国医疗卫生产生了巨大压力。脑部血流减少后，脑组织会产生一系列炎性级联效应，包括炎症因子的表达、氨基酸毒性的兴奋、神经元细胞死亡、周围去极化四个不同的机制，且各机制在发生时间上可相互影响、互成因果。其中炎症反应是损伤级联反应发生过程中氧自由基、细胞因子及促炎酶共同促发的结果。细胞因子既可通过作用于内皮细胞，将受体激活，从而使白细胞进入脑内，又可以直接刺激小胶质或星形胶质细胞释放有害成分，最终形成脑损伤。病与证结合既体现了中医的基本理论，又结合了西医学理论与动物实验学的知识，运用西医学的病因理论制备了动物的疾病，同时将中医的证候建立在疾病的模型中，使动物模型中的证候与疾病相融合，使其具有较好的稳定性和可靠性，并且可以动态的分阶段的、系统的进行观察与研究，因此病证结合动物模型的研究已成为现代中医药研究模式的一个重要发展趋势，对脑梗死的疾病发病机制及用药探索有着重大的实际应用意义。
　　目的：
　　1.通过检测痰热腑实脑缺血再灌注模型大鼠血脂血糖等指标，明确脑缺血痰热腑实模型应激性代谢功能的变化，观察扎里奴思方对脑梗死代谢功能紊乱的调节作用。
　　2.通过观察脑缺血再灌注后痰热腑实型大鼠神经功能和神经元细胞的病理变化，明确扎里奴思方对神经细胞的保护作用。
　　3.通过观察脑缺血再灌注痰热腑实型模型大鼠经再灌注后炎性相关因子表达的情况，从扎里奴思方对其变化的影响，明确其可能的作用机制；
　　方法：
　　Sprague Dawley大鼠，雄性，250只，SPF级，将其随机分为正常组、假手术组、单纯脑梗死组、痰热腑实组、尼莫地平组、扎里奴思方组共六个组，其中正常组10只，其余各组分为1天、3天、7天3个取材时间点每个时间点15只大鼠；正常组、假手术组、单纯脑梗死组给予生理盐水灌胃，其余各组大鼠通过药物灌胃制备痰热腑实证候模型，痰热腑实模型完成后行大脑中动脉阻塞(MCAO)手术，术后2小时进行缺血再灌注；对模型大鼠的宏观表现进行观察，对大鼠的神经功能采用Longa5级4分法进行评分，大鼠脑组织神经元细胞采用苏木精-伊红(Hematoxylin and Eeosin staining-HE)染色法观察；检测模型大鼠总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、血糖(glucose,GLU）、低密度脂蛋白(low- densitylipoprotein,LDL)等能量代谢指标的变化；运用免疫组化测定各取材点缺血侧脑组织中TNF-α、白介素6、VCAM-1、ICAM-1阳性细胞数，实时荧光定量（Real-time PCR，RT-PCR）法测定各因子mRNA的表达，探讨扎里奴思方对痰热腑实脑缺血模型大鼠炎性级联反应及能量代谢的影响及其神经保护机制。
　　结果：
　　1.痰热腑实模型大鼠在脑缺血再灌注后血脂及血糖等指标的变化及扎里奴思方对其的影响
　　相比正常组，单纯脑梗死组大鼠甘油三酯、血糖均有显著的增高（P＜0.05）；痰热腑实模型组大鼠血糖较假手术组和单纯脑梗死组升高（P＜0.05)；总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白相比假手术组明显上升（P＜0.05)；与痰热腑实1天组比较，尼平组TC、TG、LDL-C显著降低（P＜0.05)；痰热腑实3天组比较尼莫地平3天组TC、TG、LDL-C差异显著（P＜0.05)；扎方组1天、3天、7天组与痰热腑实组相比TC、TG、LDL-C均有显著降低（P＜0.05)；HDL-C有明显的升高（P＜0.05)；GLU在尼平组和扎方组3天、7天时显著减少（P＜0.05)。
　　2.痰热腑实脑缺血模型大鼠再灌注后神经细胞损伤及扎里奴思方的保护作用
　　假手术组大鼠未出现评分升高的表现，经过MCAO手术后的大鼠较假手术组和正常组相比，神经功能评分明显升高；单纯脑梗死组及痰热腑实组大鼠与假手术组相比，1天、3天、7天的神经功能评分均明显升高（P＜0.01)，尤以1天组大鼠上升最为明显，且痰热腑实模型组神经功能缺损较单纯脑梗死组明显；给药后，扎里奴思方组和尼莫地平组大鼠在各时间点神经功能评分均开始降低，并随给药时间延长，评分下降明显（P＜0.05）；尼莫地平组神经功能评分较扎里奴思方组略高。
　　3.痰热腑实模型大鼠脑缺血再灌注后脑组织神经元细胞形态的改变及扎里奴思方对其的影响
　　扎里奴思方对痰热腑实脑缺血再灌注大鼠缺血侧脑细胞的影响：HE染色结果显示，与单纯脑梗死组相比，假手术组海马组织结构排列整齐，胞体、核仁清晰，染色均匀,神经元细胞排列紧密；模型组海马组织细胞结构松散，排列散乱，神经元细胞消失较多，部分神经细胞胞核变小，细胞间质内可见大小不等的空泡，细胞核深染且核仁消失，皱缩，界限不清，大部分有退形性改变，神经细胞有嗜酸性改变；扎方组和尼平组神经细胞排列稍乱，仍可见细胞固缩，其周边可见神经细胞轻度肿胀，胞浆、胞膜、胞核尚能分清，程度较模型组明显减轻，扎方组较尼莫地平组改善明显。
　　4.痰热腑实模型大鼠脑缺血再灌注后炎症因子的表达及扎里奴思方对其的影响
　　4.1.扎里奴思方对TNF-α表达的影响
　　TNF-α在假手术组中表达较少，单纯脑梗死组与假手术组相比阳性细胞数增多明显（P＜0.01)；随着时间的延长，TNF-α阳性细胞数呈下降趋势，与假手术组相比仍较高；尼平组与扎方组相对痰热腑实组来说，TNF-α阳性细胞数都有所下降（P＜0.01)，以扎里奴思方1d，3d时下降更为明显（P＜0.05)；模型组各时间点比假手术组TNF-αmRNA表达升高显著(P＜0.01)；尼平组和扎方组相比模型组TNF-α mRNA表达降低明显(P<0.01)；扎里奴思方组较尼莫地平各组TNF-α mRNA表达有所降低，其中扎里奴思方1、7天降低明显(P<0.05)。
　　4.2.扎里奴思方对IL-6β表达的影响
　　单纯脑梗死组IL-6阳性细胞数比假手术组增多明显（P＜0.05)；扎里奴思方组各时间点与单纯脑梗死组及痰热腑实组比较差异亦均有显著性（P＜0.05)；与尼平组比较扎方组在1天、3天时均具有显著差异（P＜0.05)；在假手术组中IL-6 mRNA表达较低，模型组各时间点相比假手术组，IL-6 mRNA表达显著升高(P<0.01)，在3天时达到高峰；尼莫地平组和扎里奴思方组相比模型各组，IL-6 mRNA表达明显降低(P<0.01)；扎方各组相比尼平1天、3天、7天组，IL-6 mRNA表达降低明显（P＜0.05)。
　　4.3.扎里奴思方对ICAM-1表达的影响
　　假手术组中ICAM-1阳性细胞较少表达，单纯脑梗死组相比，假手术组大鼠缺血侧脑组织中阳性细胞表达升高明显（P＜0.01)；在术后1天表达最多，扎方组与尼平组大鼠缺血侧脑组织中阳性细胞表达减少且与模型组各组相比差异明显（P＜0.01)；扎方组相比尼平组，在1天、3天时减少明显；脑缺血后1天、3天、7天，模型组ICAM-1 mRNA的表达明显升高，3天后开始减少（P＜0.01)；痰热腑实组在7天时较单纯脑梗死组表达稍有增多；扎方各组和尼平各组与非给药组比较，ICAM-1 mRNA的表达都明显降低，（P＜0.01，P＜0.05）；扎方各组与尼平1天、3天、7天组比较ICAM-1 mRNA表达降低明显（P＜0.05）。
　　4.4.扎里奴思方对VCAM-1表达的影响
　　假手术组中VCAM-1阳性细胞表达较少，单纯脑梗死组与假手术组相比，各时间点VCAM-1细胞阳性表达明显增多(P<0.05)；扎方组和尼莫地平组各时间点VCAM-1细胞阳性表达明显减少(P<0.05)；扎里奴思方与尼莫地平组相比，1天组VCAM-1细胞阳性表达降低尤其显著(P<0.05)；VCAM-1 mRNA在假手术组中已有少量表达，模型组各时间点假手术组相比，VCAM-1 mRNA显著升高(P<0.01)；相比非用药组，扎方组和尼平组VCAM-1 mRNA表达明显降低(P<0.01，P<0.05)；扎方各组相比尼平1天、3天、7天组VCAM-1 mRNA表达明显降低(P<0.05)。
　　结论：
　　1.痰热腑实模型大鼠在脑缺血再灌注反应后应激性出现血糖、TG、胆固醇、LDL的升高，HDL的降低，应用扎里奴思方后大鼠血糖及血脂水平均有不同程度的改善，说明其对梗死后脂质的代谢有促进作用。
　　2.痰热腑实模型大鼠在脑缺血损伤后神经细胞出现不同程度的损伤并表现出神经功能缺失症状，扎里奴思方可促进受损细胞的恢复并改善其神经功能缺损程度。
　　3.大鼠经脑缺血再灌注后炎性因子的表达明显增多，运用扎里奴思方后可明显降低其表达，说明其可能是通过抑制炎性级联反应发挥脑保护作用。

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